本文關鍵詞： 秀麗隱桿線蟲 泛耐藥 肺炎克雷伯桿菌 感染 模型　出處：《南方醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：1研究目的及背景肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)屬于革蘭氏陰性桿菌,廣泛分布于自然界,是院內(nèi)和社區(qū)獲得性感染的重要腸桿菌科細菌。肺炎克雷伯桿菌屬條件致病菌,存在于人體的呼吸道及腸道,當人體的免疫力低下時,則會侵入人體導致人體持續(xù)的感染。它會引起一系列的感染,包括重癥肺炎、泌尿道感染、膽道感染、菌血癥和化膿性腦膜炎等嚴重疾病。臨床報道,化膿性肝膿腫合并腦膜炎的重癥患者,其死亡率達20-55%[1]。無論肺炎克雷伯桿菌感染的部位,它都會在人體的胃腸道定植,當繁殖一定程度會形成生物膜,通過氧化應激能力和增強其耐藥性來產(chǎn)生持續(xù)的感染,抵御人體的免疫能力[2]。近年來,隨著碳青霉烯類抗生素的長期、大量、廣泛使用,導致耐碳青霉烯類腸桿菌科(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)菌株的檢出率呈逐年上升趨勢。2014年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)腸桿菌科細菌中,均存在CRE菌株,以克雷伯菌屬為最多,該菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均超過10%[3]。由于CRE菌株往往呈泛耐藥(extensively drug resistant,XDR)或全耐藥(pandrugresistant, PDR)的特征,導致感染患者可能陷入無藥可用的困境[4]。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是一種國際公認、簡單有效的的模式生物。近年來,以其結構簡單、遺傳背景清晰、生命周期短等特點,在病原菌研究中的應用越來越廣泛,包括研究病原菌的致病機制,宿主免疫反應以及藥物篩選等方面。目前已證實大約40種人類致病菌(包括G+菌、G-菌和真菌)會對線蟲造成感染,其致病機制與其在哺乳動物中的表現(xiàn)有極大的相似之處[5]。鑒于國內(nèi)關于肺炎克雷伯桿菌感染秀麗隱桿線蟲尚未報道,本文旨在建立秀麗隱桿線蟲-肺炎克雷伯桿菌感染模型及致病性研究,為臨床抗感染治療提供實驗依據(jù)。2實驗方法2.1線蟲的培養(yǎng)線蟲按照國際標準程序進行培養(yǎng)。2.2線蟲同期化處理將線蟲培養(yǎng)基的平板放置于體視顯微鏡下觀察,選擇沒有細菌污染的、產(chǎn)卵期成蟲較多的平板,用巴氏吸管吸取M9緩沖液,反復清洗平板,確保盡可能將平板上的產(chǎn)卵期線蟲都轉(zhuǎn)入到15 ml的離心管中。用M9緩沖液從NGM培養(yǎng)板上洗下蟲體,收集、離心、棄上清,剩余3.5 ml,加入1.5 ml的線蟲裂解液,劇烈震蕩約8 min,離心,用移液槍輕輕地吸取上清,注意不要觸碰離心管底部的蟲卵,然后繼續(xù)M9洗滌3次,20℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集L1期的線蟲,獲得的L1期幼蟲,將其置于新的NGM平板的E.coli OP50菌苔上,20℃培養(yǎng)48 h,即得到同步化的L4期線蟲,備用。2.3菌懸液的配置從-80℃冰箱中取出塑料凍存管,然后將凍存的細菌放入5 ml的LB培養(yǎng)液中,放置于培養(yǎng)箱中,調(diào)整溫度為35℃,培養(yǎng)12-18 h。應用平板劃線法進行接種、培養(yǎng),37℃、18-20 h,分離出單個菌落。挑取單個的菌落,再接種于5 ml的LB液體培養(yǎng)基中,放入恒溫恒濕的培養(yǎng)箱,35℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)一定時間,采用比濁儀調(diào)整細菌的濃度為0.5麥氏單位,然后做進一步稀釋至所需要的濃度。2.4線蟲感染液體致死實驗將培養(yǎng)至L4期的線蟲用M9緩沖液從平板上沖洗下來,離心(3500r/min,3 min),重復2-3次,懸浮后取10 u1的M9緩沖液,在顯微鏡下觀察線蟲懸液中線蟲的數(shù)量,然后分別取含有20-30條線蟲的懸液置于96孔板中,感染組加入終濃度為1.5×108 CFU/ml、1.5×107 CFU/ml、1.5×106 CFU/ml的XDRKP;終濃度109CFU/ml E.coli OP50作為陰性對照組,20% LB溶液作為空白對照組；每種菌液做5個平行,其中為了防止N2線蟲繁殖,滴加0.2mmol/L的FUDR,96孔板放置于相對濕度80%-85%的培養(yǎng)箱,20℃培養(yǎng),每天記錄線蟲的存活數(shù)。所有組均重復3次。2.5線蟲腸道內(nèi)細菌計數(shù)及鑒定2.5.1 線蟲腸道內(nèi)細菌計數(shù)為確定線蟲腸道內(nèi)肺炎克雷伯桿菌的定植及繁殖,參照文獻報道[6]的細菌計數(shù)方法。選取1.5×108 CFU/ml XDRKP感染線蟲,每孔含有20-30條線蟲的懸液置于96孔板中,每隔一定的時間,從1個空中挑取10條經(jīng)細菌感染的線蟲,用含有1 mmol/L NaN3(麻醉劑)的M9緩沖液清洗3遍,以清除線蟲體表的細菌,然后轉(zhuǎn)移至裝有400 mg石英砂的小試管,加1 ml PBS緩沖液,渦旋振蕩2-3 min,得到的上清懸浮液稀釋涂布,計數(shù),以確定每條線蟲體內(nèi)細菌數(shù)量。各時間點均計數(shù)6次。2.5.2線蟲腸道內(nèi)細菌鑒定經(jīng)上述2.5.1步驟得到的上清懸液,于LB固體平板劃線法分離單菌落,經(jīng)細菌純培養(yǎng)后,由美國BD公司生產(chǎn)的PHOE-NIX-100型全自動細菌鑒定儀重新鑒定及藥敏測試。2.6不同耐藥程度KP對線蟲致病性研究選取終濃度1.5×108CFU/ml不同耐藥程度的KP感染線蟲,每孔含有20-30條線蟲轉(zhuǎn)移至96孔板,感染組：分為A、B、C三組,分別加入菌株A(敏感菌株)、菌株B(多重耐藥菌株)、菌株C(泛耐藥菌株)；陰性對照組：E.Coli OP50。每種菌液做5個平行,其中為了防止N2線蟲繁殖,滴加0.2 mmol/L的FUDR,在20℃培養(yǎng)指定的時間,每天記錄線蟲的存活數(shù)。所有組均重復3次。2.7感染線蟲的救治實驗選取1.5×108 CFU/ml的MDRKP和XDRKP感染線蟲(方法同2.4),經(jīng)過24 h細菌感染的線蟲用M9緩沖液清洗后,轉(zhuǎn)入含20%LB的M9緩沖液,用96孔板進行培養(yǎng)�？垢腥局委熃M：加入不同濃度抗生素(0、2、8、32 ug/ml美羅培南及0、0.08、0.4、2和10 ug/ml替加環(huán)素)；陰性對照組：不加任何抗生素,對線蟲進行抗感染治療。每組實驗平行做3組。2.8救治實驗線蟲腸道內(nèi)細菌計數(shù)在表觀觀察線蟲存活數(shù)量和狀態(tài)的基礎上,對替加環(huán)素10 ug/ml救治的線蟲進行了體內(nèi)細菌跟蹤計數(shù)(方法同2.6)。2.9統(tǒng)計分析應用SPSS 20.0軟件,采用Kaplan-Meier方法進行生存分析,Log-rank檢驗法對組間的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。計量資料采用完全隨機設計方差分析,兩兩比較采用SNK檢驗分析。P0.05表示差異顯著,P0.05表示差異不顯著。3結果3.1 XDRKP對線蟲的感染致死的判定XDRKP線蟲的感染情況,在液體實驗條件,觀察到活蟲呈正弦曲線特征,咽部肌肉運動；而XDRKP感染的死亡線蟲呈直線型,咽部無運動。3.2不同濃度XRDKP對線蟲感染的致死作用本實驗根據(jù)病原菌自身生長特點,對數(shù)生長末期收集的菌液,線蟲感染后活動明顯遲緩,效果明顯。實驗采用不同細菌濃度XDRKP感染線蟲,以線蟲是否死亡為結局變量,記錄線蟲的生存狀況以及做生存分析。結果顯示,其中7 d觀察線蟲生存狀況,不同細菌濃度(1.5×108CFU/ml、1.5×107CFU/ml、1.5×106 CFU/ml XDRKP 以及109 CFU/ml E.coli OP50對照組)的線蟲平均存活率分別為0%、25.31%、83.95%、100%。隨著細菌濃度減少,線蟲的最長存活時間與線蟲半數(shù)致死時間(lethal time of 50%,LT50)有所延長,如表1所示。采用log-rank檢驗顯示,1.5×106CFU/ml XDRKP組與109CFU/ml E.cili OP50對照組的生存曲線無統(tǒng)計學差異(χ2=0.08,P0.05),1.5×108CFU/ml組與109CFU/ml E.coli OP50對照組的生存曲線有統(tǒng)計學差異(χ2=275.98,P0.001),1.5×107CFU/ml XDRKP組與109CFU/ml E.coli OP50對照組的生存曲線有統(tǒng)計學差異(χ2=229.37,P0.001),說明1.5×108CFU/ml與1.5×107CFU/mlXDRKP組的生存率低于對照組。3.3感染實驗線蟲腸道內(nèi)細菌鑒定及計數(shù)在表觀觀察線蟲存活數(shù)量和狀態(tài)的基礎上,感染不同時間對線蟲進行了體內(nèi)細菌跟蹤計數(shù)。經(jīng)方差分析,不同時間XDRKP感染線蟲體內(nèi)細菌總量存在統(tǒng)計學差異(F=1363.389,P0.001)。經(jīng)SNK檢驗顯示,各時間點間體內(nèi)細菌總量均有統(tǒng)計學差異(P0.05),說明在實驗時間范圍內(nèi),隨時間延長,XDRKP感染線蟲體內(nèi)細菌總量逐漸增加。實驗得到的上清懸液,經(jīng)細菌純培養(yǎng)后,進行細菌鑒定和藥敏測試,結果鑒定證實為XDRKP。3.4不同耐藥程度的肺炎克雷伯桿菌對線蟲的致死作用實驗采用不同耐藥程度的肺炎克雷伯桿菌感染線蟲,以線蟲是否死亡為結局變量,記錄線蟲的生存狀況以及做生存分析。結果顯示,隨著耐藥程度的增強,線蟲的最長存活時間與LTso都有所降低,如表3-4所示。采用log-rank檢驗顯示,A組與B組(χ2=56.08,P0.001)、A組與C組(χ2=107.69,P0.001)、B組與C組(χ2=14.60,P0.001),三組之間的生存曲線均有統(tǒng)計學差異,說明隨著耐藥性增強,同時也增強了對線蟲的致死性。3.5抗生素對感染線蟲的救治3.5.1美羅培南與替加環(huán)素對MRDKP感染線蟲的救治實驗采用美羅培南(0、2、8、32 ug/ml)和替加環(huán)素(0、0.08、0.4、2和10 ug/ml)分別對MDRKP感染的線蟲進行救治。以線蟲是否死亡為結局變量,記錄線蟲的生存狀況以及做生存分析。隨著美羅培南治療濃度的增加,MDRKP感染線蟲的最長存活時間與LTso都有所延長。采用log-rank檢驗顯示,2 ug/ml美羅培南救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別無統(tǒng)計學意義(χ2=3.028,P=0.08)；8 ug/ml美羅培南救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學意義(χ2=21.821,P0.001)；32 ug/ml美羅培南救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學意義(χ2=146.096,P0.001),說明8ug/ml、32 ug/ml美羅培南救治組的生存率高于對照組。隨著替加環(huán)素治療濃度的增加,MDRKP感染線蟲的最長存活時間與LTso都有所延長。采用log-rank檢驗顯示,0.08ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別無統(tǒng)計學意義(χ2=0.116,P=0.73)；0.4 ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學意義(χ2=35,462,P0.001);2 ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學意義(χ2=106.159,P0.001),10 ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學意義(χ2=264.426,P0.001),說明0.4 ug/ml、 2ug/ml、10 ug/ml替加環(huán)素救治組的生存率高于對照組。3.5.2美羅培南與替加環(huán)素對XRDKP感染線蟲的救治實驗采用美羅培南(0、2、8、32 ug/ml)和替加環(huán)素(0、0.08、0.4、2和10 ug/ml)分別對XDRKP感染的線蟲進行救治。以線蟲是否死亡為結局變量,記錄線蟲的生存狀況以及做生存分析。隨著美羅培南治療濃度的增加,XDRKP感染線蟲的最長存活時間與LTso未有延長。采用log-rank檢驗顯示,2 ug/ml美羅培南救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別無統(tǒng)計學意義(χ2=0.749,P=0.39)；8 ug/ml美羅培南救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別無統(tǒng)計學意義(χ2=1.841,P=0.17)；32 ug/ml美羅培南救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別無統(tǒng)計學意義(χ2=0.150,P=0.69),說明2ug/ml、8ug/ml、32 ug/ml美羅培南對感染線蟲均沒有治療效果。隨著替加環(huán)素治療濃度的增加,XDRKP感染線蟲的最長存活時間與LTso都有所延長。采用log-rank檢驗顯示,0.08ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別無統(tǒng)計學意義(χ2=0.316,P=0.57)；0.4 ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學意義(χ2=28.124,P0.001)：2 ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學意義(χ2=94.767,P0.001),10 ug/ml替加環(huán)素救治組與空白對照組比較的生存曲線的差別有統(tǒng)計學意義(χ2=267.963,P0.001),說明0.4 ug/ml、2 ug/ml、10 ug/ml替加環(huán)素救治組的生存率高于對照組。3.6救治實驗線蟲腸道內(nèi)細菌計數(shù)在表觀觀察線蟲存活數(shù)量和狀態(tài)的基礎上,選擇替加環(huán)素10 ug/ml救治的線蟲進行了體內(nèi)細菌跟蹤計數(shù)。經(jīng)方差分析,不同時間點線蟲體內(nèi)細菌總量整體比較存在統(tǒng)計學差異(F=1267.23,P0.001)。經(jīng)SNK檢驗顯示,各組之間體內(nèi)細菌總量均有統(tǒng)計學差異(P0.05),說明在實驗時間范圍內(nèi),隨時間延長,線蟲體內(nèi)細菌數(shù)量逐漸下降,替加環(huán)素救治效果顯著。4結論4.1 本文利用臨床分離的XDRKP菌株,成功建立了秀麗隱桿線蟲-肺炎克雷伯桿菌感染模型,并證實XDRKP在線蟲體內(nèi)定植且不斷繁殖導致線蟲的死亡。4.2不同耐藥程度的KP感染線蟲,隨著耐藥程度的增強,KP對線蟲的致病性也逐漸增強。4.3美羅培南及替加環(huán)素對感染線蟲的救治,隨著抗生素濃度的增加,對線蟲起到一定的治療作用,體內(nèi)實驗結果與體外藥敏具有一致性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R532.1;R516

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本文編號：1548104