本文關鍵詞： 脊髓灰質炎病毒 感染性克隆 拯救病毒 核定位信號　出處：《吉林大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：嚴重急性呼吸綜合癥（Severe acute respiratory syndrome，SARS)是2003年出現(xiàn)的新發(fā)傳染病，其病情重，死亡率高，，嚴重危害人類健康。雖然SARS的病原已確定為SARS相關冠狀病毒（SARS-CoV），國內(nèi)外研究也檢測了SARS患者標本中的腺病毒、呼吸道合胞病毒、亨德拉病毒（hendra virus）、尼帕病毒（nipah virus）、流感病毒、人偏肺病毒等其他病原體，但是未曾檢測過脊髓灰質炎病毒。我們在研究SARS的過程中發(fā)現(xiàn)SARS患者標本中可能有腸道病毒屬的脊髓灰質炎病毒疫苗株SabinⅠ存在，為確證這個結果，本研究采用世界衛(wèi)生組織推薦的分離脊髓灰質炎病毒的方法和人橫紋肌肉瘤細胞系（human rhabdomyosarcoma，RD），對取自SARS患者的咽拭子標本進行病毒分離并成功獲得病毒，通過中和試驗和間接免疫熒光染色證實屬于脊髓灰質炎病毒Ⅰ型，隨后利用逆轉錄-聚合酶鏈反應、cDNA末端快速擴增（RACE）等分子生物學技術分段擴增病毒基因組并測序，從基因水平進一步證實其為脊髓灰質炎病毒SabinⅠ型疫苗類似株。在確定從SARS患者標本中分離獲得脊髓灰質炎病毒SabinⅠ型疫苗類似株后，需要從流行病學角度進一步分析其是否在更多患者中存在，因此本研究根據(jù)獲得的病毒基因組序列設計針對5′-UTR、VP3 VP1和2C-3A區(qū)3個部位的引物分別擴增SARS患者標本中提取的RNA，結果顯示38.5%(5/13)的唾液標本、37.5%(3/8)的痰標本、71.4%(5/7)的尿液標本、100%(5/5)的咽拭子標本和100%(6/6)的糞便標本中可以擴增出脊髓灰質炎病毒SabinⅠ核酸，證實71.4% (15/21)的SARS患者體內(nèi)存在脊髓灰質炎病毒SabinⅠ型且480和2795位點出現(xiàn)回復突變，其中擴增陽性患者的死亡率高于擴增陰性患者；研究結果同時顯示SARS患者的腸道和腎組織中可以檢測到脊髓灰質炎病毒SabinⅠ存在。為防止實驗結果的假陽性，研究中設置了嚴格的對照并重復驗證結果，其中對照樣本的擴增結果顯示取自25個健康人和25例肝炎患者的50份糞便標本僅1份陽性（2%），與患者組相比，其差異具有顯著性意義（p㩳0.01）。雖然在患者中沒有發(fā)現(xiàn)脊髓灰質炎相關癥狀體征，排除了疫苗相關麻痹型脊髓灰質炎的可能，但是由于研究組患者均為成年人，其體內(nèi)脊髓灰質炎病毒SabinⅠ的存在提示在脊髓灰質炎的流行病學監(jiān)測體系中，除了15歲以下的兒童，還需要加強對成人特別是嚴重呼吸道感染和免疫功能受損人群的病毒學檢測和抗體檢測，對血清脊髓灰質炎病毒中和抗體滴度顯著下降的人群應該及時加強免疫。盡管標本檢測得到了陽性結果，但是由于未能系統(tǒng)收集并檢測各種標本，導致結果分析受到限制，對脊髓灰質炎病毒SabinⅠ型疫苗類似株在SARS的發(fā)生發(fā)展中是否起作用以及有何種作用尚不能確定。 SARS患者體內(nèi)脊髓灰質炎病毒Ⅰ型疫苗類似株的首次發(fā)現(xiàn)表明需要加強脊髓灰質炎病毒疫苗株尤其是SabinⅠ的實驗研究，由于目前廣泛應用口服減毒活疫苗，且不斷出現(xiàn)疫苗相關麻痹型脊髓灰質炎，如何降低SabinⅠ基因組的回復突變率以減少疫苗衍生脊髓灰質炎病毒的產(chǎn)生是當務之急。如果能通過改造病毒的基因組使其在不降低免疫效果和安全性的前提下減少回復突變率，將有助于降低疫苗相關麻痹型脊髓灰質炎的發(fā)病率，而研究病毒基因組的功能首先需要構建感染性cDNA克隆拯救病毒。為此，在一次性擴增脊髓灰質炎病毒SabinⅠ基因組全長7441個核苷酸難度較大的情況下，本研究利用SabinⅠ基因組序列中2470位的限制性內(nèi)切酶NheⅠ識別位點和5601位的限制性內(nèi)切酶BglⅡ識別位點，通過分別擴增基因組1nt-2497nt、2412nt-5616nt和5588nt-7441nt核苷酸序列并插入克隆載體，然后分步酶切連接的方法成功獲得脊髓灰質炎病毒SabinⅠ感染性cDNA克隆。在感染性克隆構建成功后開展了SabinⅠ病毒拯救研究，本文在轉錄獲得病毒RNA的步驟中，沒有選擇常用但是昂貴、費力的體外轉錄，而是首次在脊髓灰質炎病毒拯救中利用近年來開始出現(xiàn)的真核表達載體細胞內(nèi)表達T7RNA聚合酶后轉錄RNA的技術，結果成功拯救SabinⅠ，從而為進一步研究脊髓灰質炎病毒SabinⅠ的基因功能奠定了基礎。核定位信號有助于將蛋白質從細胞胞漿內(nèi)轉運到細胞核內(nèi)，以往有關包括脊髓灰質炎病毒在內(nèi)的腸道病毒拯救的研究中，體內(nèi)拯救時細胞內(nèi)表達的T7RNA聚合酶都沒有涉及核定位信號，為了解核定位信號對病毒拯救效果的影響，本研究在拯救病毒時分別構建了含與不含SV40大T抗原核定位信號PKKKRKV的T7RNA聚合酶真核表達質粒，然后將其分別與脊髓灰質炎病毒SabinⅠ感染性cDNA克隆共轉染細胞，結果發(fā)現(xiàn)雖然表達含或不含核定位信號的T7RNA聚合酶都能夠拯救病毒，但是表達含核定位信號的T7RNA聚合酶拯救病毒的效果要優(yōu)于不含核定位信號的T7RNA聚合酶，提示脊髓灰質炎病毒SabinⅠ感染性cDNA克隆的轉錄優(yōu)勢部位可能在細胞核內(nèi)，推測其與細胞核內(nèi)轉錄因子等轉錄相關分子較多有關，這是在腸道病毒拯救機制研究中的首次發(fā)現(xiàn)。由于脊髓灰質炎病毒SabinⅠ型的自然復制主要在胞漿內(nèi)，研究結果顯示病毒自然復制與病毒拯救的差異，從而有助于脊髓灰質炎病毒細胞內(nèi)拯救機制的研究。 為尋找降低脊髓灰質炎病毒SabinⅠ回復突變率的方法，本研究采用單引物二次PCR的方法將SabinⅠ感染性cDNA克隆3D聚合酶第64位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸并成功獲得拯救病毒，初步結果顯示突變后SabinⅠ感染性克隆的病毒拯救效率下降，為下一步研究突變后拯救病毒的生長特性、毒力和回復突變率奠定了基礎。 總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)成人SARS患者體內(nèi)存在脊髓灰質炎病毒疫苗株SabinⅠ，并發(fā)現(xiàn)在T7RNA聚合酶中插入核定位信號有助于脊髓灰質炎病毒的拯救，這些結果有助于脊髓灰質炎流行病學和脊髓灰質炎病毒拯救機制的研究。
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【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392.11

【參考文獻】

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