本文關(guān)鍵詞： 高氧 肺損傷 A549 二氮嗪 線粒體ATP敏感鉀通道 凋亡 Omi/HtrA2　出處：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：探討線粒體ATP敏感鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channel,mitoKATP)對高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細胞凋亡的保護作用。方法：以人肺泡上皮A549細胞為研究對象,體外傳代培養(yǎng)A549細胞系。以3L/min的900ml/L氧氣和50ml/L二氧化碳高純混合氣作為攻擊因素處理A549細胞。實驗將A549細胞共分為三組：對照組(n=8)、高氧組(n=8),二氮嗪組(n=8)。對照組：加入含100mL/L胎牛血清培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)；高氧組：加入等量含100mL/L胎牛血清培養(yǎng)液,換液后,通入3L/min的90%氧氣和5%二氧化碳高純混合氣10min,密閉培養(yǎng)；二氮嗪組：用終濃度為100μmol/L的等量二氮嗪培養(yǎng)液預(yù)處理24h后,再用高氧誘導(dǎo)A549細胞,密閉培養(yǎng)12、24、48h收集細胞指標檢測如下指標：倒置相差顯微鏡下觀察A-549細胞的形態(tài)學(xué)改變并照相；CCK-8法檢測A549細胞活力；流式細胞儀檢測細胞凋亡；免疫組化法檢測細胞內(nèi)Omi/HtrA2的表達；激光共聚焦顯微鏡檢測線粒體膜電位變化；透射電鏡法檢測細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：(1)倒置顯微鏡下：對照組細胞貼壁良好,呈鋪路石樣,為扁圓的多角形,細胞排列緊密,連接成片,數(shù)量多,懸浮細胞少,分裂相多。高氧組細胞受損明顯,形態(tài)改變,由典型的扁圓多角形細胞變?yōu)閳A形或橢圓形,細胞間空隙加大,連接松散,活細胞數(shù)量明顯降低,懸浮細胞明顯增多；二氮嗪組細胞損傷狀況明顯得到改善,細胞生長狀況明顯好轉(zhuǎn),形態(tài)明顯變好,較高氧組活細胞數(shù)量增加,懸浮細胞數(shù)減少,但未恢復(fù)到對照組水平；(2)與對照組(0.34±0.03)比,高氧組細胞活力(0.13±0.02)下降(P0.01)；與高氧組相比,二氮嗪組細胞活力(0.21±0.04)增加,但未恢復(fù)至對照組水平(P0.01)；(3)與對照組(0.40%±0.10%)比,高氧組凋亡率(6.54%±0.48%)明顯增加(P0.01)；與高氧組相比,二氮嗪組凋亡率(2.36%±0.51%)明顯降低,差異有顯著性p0.01)。(4)與對照組(15.26±2.80)相比,高氧組A549細胞內(nèi)Omi/HtrA2的表達(44.94±4.47)明顯增加,差異有顯著性(P0.01)；與高氧組相比,二氮嗪組Omi/HtrA2的表達(28.22±1.07)明顯降低,差異有顯著性(P0.01)；(5)激光共聚焦顯微鏡下：與對照組(1.92±0.11)相比,高氧組細胞線粒體膜紅/綠熒光強度比值(1.00±0.08)明顯降低,差異有顯著性(P0.01)；與高氧組相比,二氮嗪組A549細胞線粒體膜紅/綠熒光強度比值(1.57±0.08)增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。(6)對照組A549細胞結(jié)構(gòu)完整,胞核呈橢圓形,胞漿內(nèi)可見大量多泡體,線粒體結(jié)構(gòu)清晰,未見腫脹；高氧組胞核圓形,核仁明顯,大量線粒體腫脹,電子密度減低,嵴減少；二氮嗪組可見細胞胞核小,圓形,胞質(zhì)電子密度較高,線粒體呈空泡狀,線粒體嵴減少。結(jié)論：二氮嗪可能通過穩(wěn)定線粒體膜電位,減少Omi/HtrA2表達,從而減少A549細胞凋亡來明顯減輕高氧誘導(dǎo)的人肺泡上皮細胞的損傷。
[Abstract]:Aim: to investigate the protective effect of mitochondrial ATP sensitive potassium channel (ATP) on apoptosis of human alveolar epithelial cells induced by hyperoxia. A549 cell line was subcultured in vitro. A549 cells were treated with 3L / min of 900ml / L oxygen and 50ml / L carbon dioxide high purity mixture as attack factors. A549 cells were divided into three groups: control group, hyperoxia group, diazazine group, and control group. Fetal bovine serum containing 100 mL / L fetal serum was cultured in routine culture medium. In the hyperoxia group, 100 mL / L fetal bovine serum was added into the culture medium, and then the mixture of 90% oxygen and 5% carbon dioxide of 3 L / min was added to the medium for 10 minutes, and the diazazine group was pretreated with the same amount of diazazine at the final concentration of 100 渭 mol/L for 24 hours. A549 cells were induced by hyperoxia, and the cell indexes were collected for 48 hours. The morphological changes of A-549 cells were observed under inverted phase contrast microscope, and the viability of A549 cells was detected by CCK-8 method, and apoptosis was detected by flow cytometry. Immunohistochemical method was used to detect the expression of Omi/HtrA2 in cells; laser confocal microscopy was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential; transmission electron microscopy was used to detect the ultrastructure of cells. The cells in the hyperoxia group were obviously damaged and changed from typical round polygonal cells to round or elliptical cells. The gap between cells was enlarged, the connection was loose, the number of living cells was obviously decreased, the number of suspended cells was obviously increased, the condition of cell damage, cell growth and morphology of diazazine group were obviously improved. In hyperoxia group, the number of living cells increased, but the number of suspended cells decreased, but did not return to the level of control group (0.34 鹵0.03). Compared with the control group, the cell viability of hyperoxia group decreased by 0.13 鹵0.02, and that of diazazine group increased by 0.21 鹵0.04 compared with that of hyperoxia group. The apoptotic rate of hyperoxia group (6.54% 鹵0.48) was significantly higher than that of control group (P 0.01% 鹵0.51%), and the apoptotic rate of diazazine group (2.36% 鹵0.511) was significantly lower than that of hyperoxia group (P 0.01% 鹵0.41%), compared with that of control group (15.26 鹵2.80). The expression of Omi/HtrA2 in A549 cells in hyperoxia group (44.94 鹵4.47) was significantly higher than that in hyperoxidised group (P 0.01 鹵0.11), and the expression of Omi/HtrA2 in diazazine group was significantly lower than that in hyperoxide group (P 0.01 鹵1.07). The ratio of red / green fluorescence intensity of mitochondria membrane in hyperoxia group (1.00 鹵0.08) was significantly decreased, the difference was significant (P 0.01), and the ratio of red / green fluorescence intensity of A549 cells in diazazine group was 1.57 鹵0.08, compared with that in hyperoxidised group (1.57 鹵0.08). The difference was statistically significant (P 0.01. 0. 0. 6) the A549 cells in the control group had intact structure, oval nucleus, a large number of vesicular bodies in the cytoplasm, clear mitochondria structure and no swelling, while in the hyperoxia group, the nucleus was round, the nucleolus was obvious, and a large number of mitochondria were swollen. In the diazazine group, the nucleus of the cells was small, round, the cytoplasm electron density was high, the mitochondria were vacuolated, and the mitochondria cristae were decreased. Conclusion: diazazine may decrease the Omi/HtrA2 expression by stabilizing the mitochondrial membrane potential. Thus, the apoptosis of A549 cells was reduced to alleviate the injury of human alveolar epithelial cells induced by hyperoxia.
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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