本文關(guān)鍵詞： rhBHMT 表達(dá) 純化 HCY 高同型半胱氨酸血癥　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:建立一種制備重組人甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(recombinant human betaine-homocysteine S-methyltransferase,rhBHMT)藥用蛋白的生物工程技術(shù),獲得高純度并具有穩(wěn)定生物學(xué)活性的rhBHMT藥用蛋白,確認(rèn)其防治高同型半胱氨酸血癥的藥效學(xué)作用。 方法:采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆獲得rhBHMT基因;采用大腸桿菌BL21作為原核表達(dá)系統(tǒng)對rhBHMT蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),構(gòu)建和篩選rhBHMT蛋白高效和可溶性表達(dá)的工程菌株。采用DEAE Sepharose Fast Flow層析柱和CM陽離子層析柱對原核表達(dá)的rhBHMT蛋白進(jìn)行純化,應(yīng)用SDS-PAGE、HPLC、Lowry法等試驗(yàn)對所得蛋白進(jìn)行相對分子質(zhì)量、純度、濃度、蛋白含量分析,建立硝普鈉顯色法對rhBHMT蛋白的活性進(jìn)行檢測。以束縛應(yīng)激和高蛋氨酸飲食干預(yù)兩種方式建立高同型半胱氨酸血癥Wistar大鼠模型,給予高同型半胱氨酸血癥大鼠以不同劑量的rhBHMT蛋白,觀測對其血漿HCY水平的影響,研究rhBHMT治療高同型半胱氨酸血癥的生物學(xué)作用。 結(jié)果:構(gòu)建了rhBHMT高效、可溶性表達(dá)的工程菌株,通過上述生物工程技術(shù)系統(tǒng)分離純化其表達(dá)產(chǎn)物,獲得了純度達(dá)95 %以上的rhBHMT蛋白。所得蛋白含量為0.01-1.0 mg/ml,相對分子質(zhì)量約為43kb,在20mmol/L PH7.0的磷酸鈉緩沖液中可穩(wěn)定儲存于-20℃條件下。建立了用于檢測rhBHMT酶活性的硝普鈉顯色法,其操作簡便、重復(fù)性及穩(wěn)定性好,與氨基酸測定儀檢測結(jié)果比對的一致性好。以此硝普鈉顯色法測定該rhBHMT蛋白樣品活性約為70 U/mg。給予束縛應(yīng)激和高蛋氨酸飲食所誘導(dǎo)的高同型半胱氨酸血癥大鼠rhBHMT,可以顯著降低大鼠血漿同型半胱氨酸水平,且具有明確的劑量效應(yīng)。 結(jié)論:應(yīng)用生物工程技術(shù),構(gòu)建了rhBHMT穩(wěn)定高表達(dá)的工程菌株,建立了對表達(dá)產(chǎn)物中rhBHMT蛋白的分離純化工藝,制備了高度純化蛋白rhBHMT,完成了其重要的理化性質(zhì)和活性的鑒定,確認(rèn)了rhBHMT降低高同型半胱氨酸血癥大鼠血漿同型半胱氨酸水平的生物學(xué)作用。為rhBHMT作為治療高同型半胱氨酸血癥生物工程藥物提供了科學(xué)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective : To establish a biological engineering technology for preparing recombinant human recombinant human betaine - cysteine ( rhBHMT ) pharmaceutical protein , and to obtain rhBHMT pharmaceutical protein with high purity and stable biological activity , and confirm its effect on preventing and treating hyperhomocysteinemia . Methods : The rhBHMT gene was cloned by polymerase chain reaction ( PCR ) . The recombinant rhBHMT protein was purified by using E . coli BL21 as a prokaryotic expression system . The recombinant rhBHMT protein was purified by DEAE Sepharose Fast Flow chromatography column and CM cation chromatography column . Results : The rhBHMT protein with high efficiency and soluble expression was constructed . The rhBHMT protein was isolated and purified by the above - mentioned biological engineering system . The rhBHMT protein with purity of more than 95 % was obtained . Conclusion : rhBHMT is a highly expressed engineering strain with high expression of rhBHMT . A highly purified rhBHMT has been prepared and its important physicochemical properties and activity have been identified . The biological effects of rhBHMT on the plasma homocysteine level in rats with hyperhomocysteinemia have been confirmed .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R341

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1524572