本文關(guān)鍵詞： 細(xì)小病毒B19 VP1u蛋白 磷酸脂酶A_2 核酸疫苗　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人細(xì)小病毒B19(Human parvovirus B19)屬細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬,1975年由Cossart首次發(fā)現(xiàn)以來(lái),諸多研究證明諸多疾病的發(fā)生伴隨著B(niǎo)19病毒的感染。 B19病毒由一個(gè)二十面體衣殼蛋白包裹一條單鏈DNA(5596bp)組成。是一種無(wú)包膜且有許多理化耐受性的病原體,用一般的病毒滅活方法不能阻止其傳播。B19病毒基因編碼一個(gè)主要的非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)、兩個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(VP1和VP2)和兩個(gè)小分子量蛋白(7.5kDa和11kDa)。VP1蛋白(83kDa)蛋白末端比VP2蛋白(58kDa)多出227個(gè)氨基酸。VP1u蛋白既由這227個(gè)氨基酸所組成。VP1u蛋白具有PLA2酶活性,能夠水解脂肪酸和磷脂,刺激機(jī)體出現(xiàn)免疫紊亂。VP1u蛋白的大部分片段暴露于到病毒表面,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。VP1u蛋白在B19病毒感染發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用,也有可能成為B19疫苗的首選抗原之一。 B19病毒XA株VP1u核苷酸存在著變異,鑒于VP1u蛋白的上述特殊的作用,B19病毒XA株VP1u具有其獨(dú)特的免疫學(xué)特點(diǎn)。2009年,我們研究證實(shí),B19病毒XA株VP1u蛋白免疫動(dòng)物后可引起動(dòng)物心臟、肝臟、關(guān)節(jié)滑膜等組織發(fā)生病理改變,并可導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等酶系的升高。這可能與VP1u蛋白的PLA_2活性有關(guān),也可能與VP1u蛋白免疫動(dòng)物后蛋白與動(dòng)物細(xì)胞蛋白間的分子交叉反應(yīng)有關(guān)。這對(duì)VP1u蛋白作為B19病毒疫苗的可行性帶來(lái)了疑問(wèn),鑒于核酸疫苗與普通蛋白疫苗不同,其能在自體細(xì)胞中產(chǎn)生外源性蛋白,這種蛋白更像天然分子的蛋白的抗原提成過(guò)程與自然感染十分相似,并且可以引發(fā)宿主長(zhǎng)久的免疫應(yīng)答,因此,我們進(jìn)行了本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 研究目的: 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菢?gòu)建B19病毒VP1u基因真核表達(dá)載體,通過(guò)基因測(cè)序及真核轉(zhuǎn)染鑒定VP1u蛋白表達(dá)。而后以B19病毒XA株VP1u基因?yàn)榘谢驑?gòu)建的真核表達(dá)載體免疫動(dòng)物。對(duì)免疫后小鼠心肌組織進(jìn)行病理檢查;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)法檢測(cè)小鼠脾臟CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞分子數(shù)量變化;ELISA法檢測(cè)免疫后小鼠血清中抗體表達(dá)情況,判斷其作為核酸疫苗的可能性。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u的構(gòu)建從已構(gòu)建好的B19病毒XA株原核表達(dá)載體中獲得VP1u基因,將其克隆入真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中,經(jīng)酶切鑒定并測(cè)序驗(yàn)證后,獲得真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-VP1u。 2.重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u真核轉(zhuǎn)染及蛋白表達(dá)鑒定將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞,Western blot和免疫熒光檢測(cè)VP1u蛋白的表達(dá)。 3.重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u免疫學(xué)研究將重組載體pIRES2-EGFP-VP1u及pIRES2-EGFP空質(zhì)粒及生理鹽水分別采用肌肉注射的方法免疫BABL/c小鼠。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)法檢測(cè)小鼠脾臟CD4~+T細(xì)胞和CD8~+T細(xì)胞數(shù)量,western blot及ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中B19VP1u抗體,并對(duì)免疫后小鼠心肌組織行光鏡和電鏡檢查,判斷其作為核酸疫苗的可行性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.構(gòu)建了B19病毒XA株pIRES2-EGFP-VP1u真核表達(dá)載體,經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定和基因測(cè)序鑒定證明與我們保存的pQE30-VP1u原核表達(dá)載體中的VP1u核苷酸相同,沒(méi)有產(chǎn)生堿基突變。 2.經(jīng)過(guò)真核轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u至HeLa細(xì)胞,免疫熒光觀察和Western blot技術(shù)檢測(cè)證實(shí),可表達(dá)VP1u蛋白。 3.經(jīng)重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u免疫的BABL/c小鼠脾臟CD4~+T細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的變化,在接種疫苗第二、三個(gè)月發(fā)生明顯變化,第四個(gè)月后CD4~+T細(xì)胞逐漸回復(fù)正常,而CD8~+分子未產(chǎn)生明顯變化。小鼠心肌組織經(jīng)光鏡及電鏡檢查未提示病理變化。通過(guò)我們構(gòu)建的ELISA檢測(cè)體系可檢測(cè)到特異的抗B19病毒VP1u抗體。 結(jié)論: 1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了B19病毒XA株pIRES2-EGFP-VP1u真核表達(dá)載體,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可在Hela細(xì)胞中表達(dá)VP1u蛋白。 2.重組質(zhì)粒免疫BALB/c小鼠后,經(jīng)ELISA檢測(cè)能產(chǎn)生特異性抗體,心肌組織經(jīng)光鏡和電鏡檢查未發(fā)現(xiàn)病理變化,提示重組質(zhì)粒免疫動(dòng)物后未引起自身免疫紊亂。 3.流式細(xì)胞術(shù)雙標(biāo)法檢測(cè)小鼠脾臟CD4~+和CD8~+TT細(xì)胞數(shù)量后,發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-VP1u可以使免疫動(dòng)物脾臟脾淋巴細(xì)胞CD4~+T細(xì)胞發(fā)生變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 采華,張國(guó)成,許東亮,李飚;人細(xì)小病毒B19中國(guó)株VP1蛋白獨(dú)特區(qū)基因片段序列變異分析[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2002年16期

2 張國(guó)成;;兒童微小病毒B19感染的診斷與治療[J];臨床兒科雜志;2008年06期

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本文編號(hào)：1522962