本文關鍵詞： 細小病毒B19 VP1u蛋白 磷酸脂酶A_2 核酸疫苗　出處：《第四軍醫(yī)大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：人細小病毒B19(Human parvovirus B19)屬細小病毒科細小病毒屬,1975年由Cossart首次發(fā)現(xiàn)以來,諸多研究證明諸多疾病的發(fā)生伴隨著B19病毒的感染。 B19病毒由一個二十面體衣殼蛋白包裹一條單鏈DNA(5596bp)組成。是一種無包膜且有許多理化耐受性的病原體,用一般的病毒滅活方法不能阻止其傳播。B19病毒基因編碼一個主要的非結構蛋白(NS1)、兩個結構蛋白(VP1和VP2)和兩個小分子量蛋白(7.5kDa和11kDa)。VP1蛋白(83kDa)蛋白末端比VP2蛋白(58kDa)多出227個氨基酸。VP1u蛋白既由這227個氨基酸所組成。VP1u蛋白具有PLA2酶活性,能夠水解脂肪酸和磷脂,刺激機體出現(xiàn)免疫紊亂。VP1u蛋白的大部分片段暴露于到病毒表面,可以刺激機體產生中和性抗體。VP1u蛋白在B19病毒感染發(fā)病機制中起著關鍵作用,也有可能成為B19疫苗的首選抗原之一。 B19病毒XA株VP1u核苷酸存在著變異,鑒于VP1u蛋白的上述特殊的作用,B19病毒XA株VP1u具有其獨特的免疫學特點。2009年,我們研究證實,B19病毒XA株VP1u蛋白免疫動物后可引起動物心臟、肝臟、關節(jié)滑膜等組織發(fā)生病理改變,并可導致動物體內天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)等酶系的升高。這可能與VP1u蛋白的PLA_2活性有關,也可能與VP1u蛋白免疫動物后蛋白與動物細胞蛋白間的分子交叉反應有關。這對VP1u蛋白作為B19病毒疫苗的可行性帶來了疑問,鑒于核酸疫苗與普通蛋白疫苗不同,其能在自體細胞中產生外源性蛋白,這種蛋白更像天然分子的蛋白的抗原提成過程與自然感染十分相似,并且可以引發(fā)宿主長久的免疫應答,因此,我們進行了本項實驗。 研究目的: 本實驗目的是構建B19病毒VP1u基因真核表達載體,通過基因測序及真核轉染鑒定VP1u蛋白表達。而后以B19病毒XA株VP1u基因為靶基因構建的真核表達載體免疫動物。對免疫后小鼠心肌組織進行病理檢查;通過流式細胞術雙標法檢測小鼠脾臟CD4~+T細胞和CD8~+T細胞分子數(shù)量變化;ELISA法檢測免疫后小鼠血清中抗體表達情況,判斷其作為核酸疫苗的可能性。 實驗方法: 1.重組質粒pIRES2-EGFP-VP1u的構建從已構建好的B19病毒XA株原核表達載體中獲得VP1u基因,將其克隆入真核表達載體pIRES2-EGFP中,經(jīng)酶切鑒定并測序驗證后,獲得真核表達載體pIRES2-EGFP-VP1u。 2.重組質粒pIRES2-EGFP-VP1u真核轉染及蛋白表達鑒定將重組質粒轉染至HeLa細胞,Western blot和免疫熒光檢測VP1u蛋白的表達。 3.重組質粒pIRES2-EGFP-VP1u免疫學研究將重組載體pIRES2-EGFP-VP1u及pIRES2-EGFP空質粒及生理鹽水分別采用肌肉注射的方法免疫BABL/c小鼠。通過流式細胞術雙標法檢測小鼠脾臟CD4~+T細胞和CD8~+T細胞數(shù)量,western blot及ELISA方法檢測小鼠血清中B19VP1u抗體,并對免疫后小鼠心肌組織行光鏡和電鏡檢查,判斷其作為核酸疫苗的可行性。 實驗結果: 1.構建了B19病毒XA株pIRES2-EGFP-VP1u真核表達載體,經(jīng)過雙酶切鑒定和基因測序鑒定證明與我們保存的pQE30-VP1u原核表達載體中的VP1u核苷酸相同,沒有產生堿基突變。 2.經(jīng)過真核轉染重組質粒pIRES2-EGFP-VP1u至HeLa細胞,免疫熒光觀察和Western blot技術檢測證實,可表達VP1u蛋白。 3.經(jīng)重組質粒pIRES2-EGFP-VP1u免疫的BABL/c小鼠脾臟CD4~+T細胞產生了明顯的變化,在接種疫苗第二、三個月發(fā)生明顯變化,第四個月后CD4~+T細胞逐漸回復正常,而CD8~+分子未產生明顯變化。小鼠心肌組織經(jīng)光鏡及電鏡檢查未提示病理變化。通過我們構建的ELISA檢測體系可檢測到特異的抗B19病毒VP1u抗體。 結論: 1.本實驗成功構建了B19病毒XA株pIRES2-EGFP-VP1u真核表達載體,體外實驗證實其可在Hela細胞中表達VP1u蛋白。 2.重組質粒免疫BALB/c小鼠后,經(jīng)ELISA檢測能產生特異性抗體,心肌組織經(jīng)光鏡和電鏡檢查未發(fā)現(xiàn)病理變化,提示重組質粒免疫動物后未引起自身免疫紊亂。 3.流式細胞術雙標法檢測小鼠脾臟CD4~+和CD8~+TT細胞數(shù)量后,發(fā)現(xiàn)重組質粒pIRES2-EGFP-VP1u可以使免疫動物脾臟脾淋巴細胞CD4~+T細胞發(fā)生變化。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 采華,張國成,許東亮,李飚;人細小病毒B19中國株VP1蛋白獨特區(qū)基因片段序列變異分析[J];第四軍醫(yī)大學學報;2002年16期

2 張國成;;兒童微小病毒B19感染的診斷與治療[J];臨床兒科雜志;2008年06期

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本文編號：1522962