本文關(guān)鍵詞： 博卡病毒 環(huán)狀附加體 感染性克隆　出處：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：博卡病毒屬于細(xì)小病毒科博卡病毒屬,是近年來(lái)細(xì)小病毒中的研究熱點(diǎn)。由于博卡病毒發(fā)現(xiàn)時(shí)間較短,其在疾病中的作用,目前尚未定論。而到目前為止,所有發(fā)現(xiàn)的博卡病毒在傳統(tǒng)的細(xì)胞系中培養(yǎng)比較困難,從而無(wú)法獲得大量高純度病毒進(jìn)行下游研究；基因組水平上,除了牛和犬博卡病毒外,其他博卡病毒中對(duì)病毒增殖起關(guān)鍵作用的基因組末端反向重復(fù)序列(ITRs)尚未攻克,從而無(wú)法建立感染性克隆的研究模型。豬博卡病毒是我實(shí)驗(yàn)室于2009年首先發(fā)現(xiàn),與人博卡病毒相比具有基因組相似性高、分子生物學(xué)特征相近且標(biāo)本更易獲得、標(biāo)本中病毒載量更高的特點(diǎn),可作為人博卡病毒研究的良好切入點(diǎn)。本研究在現(xiàn)有工作基礎(chǔ)上,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)尤其是博卡病毒屬其他成員的研究方法,發(fā)現(xiàn)了一株新型豬博卡病毒并對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性進(jìn)行研究；并從基因組末端ITRs入手,在構(gòu)建豬博卡病毒的感染性克隆和復(fù)制機(jī)制方面進(jìn)行了初步探索,以期為人博卡病毒的研究奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。 方法： (一)新型博卡病毒的鑒定與分子生物學(xué)特征分析 利用新一代高通量454測(cè)序技術(shù)在健康豬糞便標(biāo)本中篩查新型別豬博卡病毒(PBoV)的基因片段。選取測(cè)序結(jié)果中位于NSl保守區(qū)并與人博卡病毒3型(HBoV3)序列相似性最高的片段作為目標(biāo),采用基因組步移技術(shù)獄得了這一新型別PBoV近似全長(zhǎng)基因組序列并對(duì)其分子生物學(xué)特征進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。 (二)博卡病毒感染性克隆構(gòu)建的初步探索 1.利用半巢式PCR方法在PBoV陽(yáng)性的豬糞便標(biāo)本中篩查環(huán)狀附加體形式存在的PBoV,通過(guò)反復(fù)測(cè)序和序列拼接獲取其末端非編碼區(qū)序列。采用軟件和在線服務(wù)器對(duì)其進(jìn)行序列分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。2.利用接頭-PCR法擴(kuò)增線性豬博卡病毒2組(即PBoVG2,為避免本文新方法命名的PBoV2與文獻(xiàn)中PBoV2-CHN、 PBoV2-H18等混淆,本文均以PBoVG2表示,而非PBoV2;同樣以新方法命名的PBoV3均以PBoVG3表示)基因組末端ITRs。3.運(yùn)用經(jīng)典酶切法構(gòu)建豬博卡病毒2組附加體(PBoVG2e)全基因組克隆。4.針對(duì)PBoVG2eNP1保守區(qū)片段設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針,建立PBoVG2e實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。 結(jié)果： (一)利用高通量測(cè)序技術(shù)在健康豬糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了一株疑似為新型別的豬博卡病毒,其在健康豬體內(nèi)檢出率高達(dá)19.6%。進(jìn)一步我們獲得了這一新型別PBoV近似全長(zhǎng)基因組序列PBoV3C(5235nt),發(fā)現(xiàn)其與PBoV3A/B (PBoV3/4-UK)和PBoV3D/E (PBoV3/4-HK)的基因組相似性分別達(dá)到78%和81%。對(duì)所有PBoV做進(jìn)化分析表明PBoV具有多樣性、普遍性和復(fù)雜性的特點(diǎn)。另外,在此分析基礎(chǔ)上,本研究還提出了基于VPl基因?qū)BoV命名的方法。 (二)1.在健康豬糞便標(biāo)本中篩查出2株以環(huán)狀附加體形式存在的豬博卡病毒PBoVG2e和PBoVG3e并得到其末端非編碼區(qū)序列(405nt和511nt)。序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PBoVG2e與HBoV3附加體結(jié)構(gòu)相似。2.利用接頭-PCR法獲得了部分線性PBoVG2基因組末端ITRs并由此確定了基于PBoVG2e構(gòu)建PBoV全基因組克隆的“頭-尾”連接點(diǎn)。3.構(gòu)建了PBoVG2e全基因組克隆并經(jīng)序列測(cè)定驗(yàn)證正確。4.建立了針對(duì)NP1保守區(qū)的PBoVG2e的real-time檢測(cè)方法。其在101拷貝水平可檢測(cè)出PBoVG2e和PBoV2-CHN,具有重復(fù)性和較高的精密度和靈敏度。 結(jié)論：本研究在健康豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一株新型別豬博卡病毒,對(duì)其分子生物學(xué)特征進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè),并在完成所有PBoV進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上,提出了基于VP1基因?qū)BoV命名的新方法,并據(jù)此將本文新發(fā)現(xiàn)的PBoV命名為PBoV3C;本研究還構(gòu)建了基于豬博卡病毒2組環(huán)狀附加體的全基因組克隆并建立了相應(yīng)的real-time PCR檢測(cè)方法,為后續(xù)博卡病毒感染性克隆的構(gòu)建和研究奠定了一定的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: Boka virus belongs to Keboka parvovirus virus, parvovirus is a research hotspot in recent years. Due to the virus found in Boka for a short period of time, its role in the disease, not yet conclusive. So far, all found Boka virus culture difficult in the traditional cell lines, which can not get a lot of high purity virus downstream research; genome level, in addition to cattle and dogs Boka virus, genome has inverted terminal repeats a key role on virus proliferation of other Boka virus (ITRs) has not been overcome, thus unable to establish the research model of infectious clone. Pig Boka virus is first discovered in our laboratory in 2009, compared with Boka has the virus genomic similarity, molecular biological characteristics and similar specimens obtained more easily, the characteristics of viral load were much higher, as one of Boka's disease A good starting point to study the virus. This study on the basis of existing work, the application of molecular biology technology especially the research methods of Boka virus belonging to other members of the discovery of a new strain of swine Boka virus and Study on its genome structure and biological characteristics; and starting from the end of the ITRs genome, a preliminary exploration on and replication mechanism construction of infectious clone of porcine Boka virus, in order to study for the Boka virus lay the theoretical and technical basis.
Method錛，

本文編號(hào)：1516515