本文關鍵詞： 博卡病毒 環(huán)狀附加體 感染性克隆　出處：《中國疾病預防控制中心》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：博卡病毒屬于細小病毒科博卡病毒屬,是近年來細小病毒中的研究熱點。由于博卡病毒發(fā)現時間較短,其在疾病中的作用,目前尚未定論。而到目前為止,所有發(fā)現的博卡病毒在傳統(tǒng)的細胞系中培養(yǎng)比較困難,從而無法獲得大量高純度病毒進行下游研究；基因組水平上,除了牛和犬博卡病毒外,其他博卡病毒中對病毒增殖起關鍵作用的基因組末端反向重復序列(ITRs)尚未攻克,從而無法建立感染性克隆的研究模型。豬博卡病毒是我實驗室于2009年首先發(fā)現,與人博卡病毒相比具有基因組相似性高、分子生物學特征相近且標本更易獲得、標本中病毒載量更高的特點,可作為人博卡病毒研究的良好切入點。本研究在現有工作基礎上,應用分子生物學技術尤其是博卡病毒屬其他成員的研究方法,發(fā)現了一株新型豬博卡病毒并對其基因組結構和生物學特性進行研究；并從基因組末端ITRs入手,在構建豬博卡病毒的感染性克隆和復制機制方面進行了初步探索,以期為人博卡病毒的研究奠定理論和技術基礎。 方法： (一)新型博卡病毒的鑒定與分子生物學特征分析 利用新一代高通量454測序技術在健康豬糞便標本中篩查新型別豬博卡病毒(PBoV)的基因片段。選取測序結果中位于NSl保守區(qū)并與人博卡病毒3型(HBoV3)序列相似性最高的片段作為目標,采用基因組步移技術獄得了這一新型別PBoV近似全長基因組序列并對其分子生物學特征進行分析和預測。 (二)博卡病毒感染性克隆構建的初步探索 1.利用半巢式PCR方法在PBoV陽性的豬糞便標本中篩查環(huán)狀附加體形式存在的PBoV,通過反復測序和序列拼接獲取其末端非編碼區(qū)序列。采用軟件和在線服務器對其進行序列分析及二級結構的預測。2.利用接頭-PCR法擴增線性豬博卡病毒2組(即PBoVG2,為避免本文新方法命名的PBoV2與文獻中PBoV2-CHN、 PBoV2-H18等混淆,本文均以PBoVG2表示,而非PBoV2;同樣以新方法命名的PBoV3均以PBoVG3表示)基因組末端ITRs。3.運用經典酶切法構建豬博卡病毒2組附加體(PBoVG2e)全基因組克隆。4.針對PBoVG2eNP1保守區(qū)片段設計引物和TaqMan探針,建立PBoVG2e實時熒光定量PCR檢測方法。 結果： (一)利用高通量測序技術在健康豬糞便標本中發(fā)現了一株疑似為新型別的豬博卡病毒,其在健康豬體內檢出率高達19.6%。進一步我們獲得了這一新型別PBoV近似全長基因組序列PBoV3C(5235nt),發(fā)現其與PBoV3A/B (PBoV3/4-UK)和PBoV3D/E (PBoV3/4-HK)的基因組相似性分別達到78%和81%。對所有PBoV做進化分析表明PBoV具有多樣性、普遍性和復雜性的特點。另外,在此分析基礎上,本研究還提出了基于VPl基因對PBoV命名的方法。 (二)1.在健康豬糞便標本中篩查出2株以環(huán)狀附加體形式存在的豬博卡病毒PBoVG2e和PBoVG3e并得到其末端非編碼區(qū)序列(405nt和511nt)。序列分析與結構預測發(fā)現PBoVG2e與HBoV3附加體結構相似。2.利用接頭-PCR法獲得了部分線性PBoVG2基因組末端ITRs并由此確定了基于PBoVG2e構建PBoV全基因組克隆的“頭-尾”連接點。3.構建了PBoVG2e全基因組克隆并經序列測定驗證正確。4.建立了針對NP1保守區(qū)的PBoVG2e的real-time檢測方法。其在101拷貝水平可檢測出PBoVG2e和PBoV2-CHN,具有重復性和較高的精密度和靈敏度。 結論：本研究在健康豬體內發(fā)現了一株新型別豬博卡病毒,對其分子生物學特征進行了分析和預測,并在完成所有PBoV進化分析的基礎上,提出了基于VP1基因對PBoV命名的新方法,并據此將本文新發(fā)現的PBoV命名為PBoV3C;本研究還構建了基于豬博卡病毒2組環(huán)狀附加體的全基因組克隆并建立了相應的real-time PCR檢測方法,為后續(xù)博卡病毒感染性克隆的構建和研究奠定了一定的理論和技術基礎。
[Abstract]:Objective: Boka virus belongs to Keboka parvovirus virus, parvovirus is a research hotspot in recent years. Due to the virus found in Boka for a short period of time, its role in the disease, not yet conclusive. So far, all found Boka virus culture difficult in the traditional cell lines, which can not get a lot of high purity virus downstream research; genome level, in addition to cattle and dogs Boka virus, genome has inverted terminal repeats a key role on virus proliferation of other Boka virus (ITRs) has not been overcome, thus unable to establish the research model of infectious clone. Pig Boka virus is first discovered in our laboratory in 2009, compared with Boka has the virus genomic similarity, molecular biological characteristics and similar specimens obtained more easily, the characteristics of viral load were much higher, as one of Boka's disease A good starting point to study the virus. This study on the basis of existing work, the application of molecular biology technology especially the research methods of Boka virus belonging to other members of the discovery of a new strain of swine Boka virus and Study on its genome structure and biological characteristics; and starting from the end of the ITRs genome, a preliminary exploration on and replication mechanism construction of infectious clone of porcine Boka virus, in order to study for the Boka virus lay the theoretical and technical basis.
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本文編號：1516515