本文關(guān)鍵詞： 生精細(xì)胞 體外培養(yǎng) RT-PCR 流式細(xì)胞術(shù) ROSI/ELSI ICSI　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的改進(jìn)探討新生小鼠睪丸組織生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的增殖分化效應(yīng)，以期提高生精細(xì)胞體外存活率，增殖率、分化率及存活時(shí)間。方法：對(duì)7~8日齡小鼠生精細(xì)胞進(jìn)行混合細(xì)胞培養(yǎng)，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液（A組）、條件培養(yǎng)液（B組（）基礎(chǔ)培養(yǎng)液+20ng/ml EGF+10ng/ml GDNF）、分別含濃度為20%、40%、80%睪丸液(testicular abstract, TA)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液（C1、C2和C3組）和分別含濃度為20%、40%、80%TA的條件培養(yǎng)液（D1、D2和D3組），通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、存活率和粗線期精母細(xì)胞特異性基因P19、單倍體精子細(xì)胞特異性基因TP1檢測(cè)及染色體倍性分析，探討TA、GDNF和EGF對(duì)小鼠生精細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖分化效應(yīng)。 結(jié)果：①形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)3～4天后均可觀察到正在分裂的細(xì)胞。B組培養(yǎng)7～8天后可觀察到細(xì)胞集落，集落間可見(jiàn)散在圓形精子細(xì)胞，培養(yǎng)10天后，細(xì)胞集落爆發(fā)出現(xiàn)，并可見(jiàn)變形精子細(xì)胞和帶鞭毛精子細(xì)胞，培養(yǎng)20天后，可見(jiàn)部分生精細(xì)胞和支持細(xì)胞凋亡。含TA（C1、C2和C3）組和（D1、D2和D3）組細(xì)胞生長(zhǎng)速度介于A組和B組之間，培養(yǎng)7～8天后也可見(jiàn)少量細(xì)胞集落，其中正在分裂細(xì)胞偏多，圓形精子細(xì)胞少見(jiàn)，培養(yǎng)10天后，細(xì)胞集落增加，并可觀察到各期生精細(xì)胞，但細(xì)胞密度低于B組，培養(yǎng)15天后，細(xì)胞集落鋪滿培養(yǎng)皿底部。對(duì)實(shí)驗(yàn)各組傳代培養(yǎng)，A組傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)不良，B組傳代至2～3代后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，且細(xì)胞暗沉發(fā)黑、貼壁性差，而C1、C2、C3組和D1、D2、D3組傳代培養(yǎng)4個(gè)月之后仍可觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)。②生精細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)各時(shí)間階段B組生精細(xì)胞數(shù)均顯著高于其余組(P＜0.05)，而A組生精細(xì)胞數(shù)則顯著低于其余各組（P＜0.05），其余各組間無(wú)顯著性差異；③生精細(xì)胞存活率培養(yǎng)第5、10和15天A與B組間細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異，但培養(yǎng)第20天A組細(xì)胞存活率顯著低于B組（P＜0.05），其余組在培養(yǎng)各階段與A、B組相比細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異；④TP1/P19A組在培養(yǎng)15天時(shí)TP1/P19顯著高于B組（P＜0.05），B組在培養(yǎng)20天時(shí)顯著高于其余組（P＜0.05），其余各培養(yǎng)組均無(wú)顯著性差異；⑤單倍體精子細(xì)胞比例B組在培養(yǎng)第15天和20天時(shí)單倍體細(xì)胞比顯著高于其余組（P＜0.05），其余各培養(yǎng)組均無(wú)顯著性差異。 結(jié)論：在生精細(xì)胞與支持細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加適量GDNF和EGF可顯著提高生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的增殖分化效應(yīng)，但不能延長(zhǎng)其體外培養(yǎng)時(shí)間；基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入適量TA，可增加生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)及時(shí)間；在含最佳濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)液中加入適量TA，降低生精細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖分化效應(yīng)，但顯著增加生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的時(shí)間。 目的：對(duì)體外培養(yǎng)獲得的圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞行卵胞漿內(nèi)顯微注射術(shù)(roundspermatid injection, ROSI; elongated spermatid injection, ELSI)，觀察其受精率、卵裂率、桑囊胚形成率，探討體外培養(yǎng)所獲單倍體精子細(xì)胞的受精能力以及受精后胚胎的發(fā)育潛能。 方法：對(duì)7~8日齡小鼠生精細(xì)胞混合細(xì)胞體外培養(yǎng)后獲得的圓形/長(zhǎng)形精子細(xì)胞和成年小鼠睪丸內(nèi)的圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞以及成熟精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)顯微授精，比較其受精率、卵裂率及桑囊胚形成率。 結(jié)果：成年小鼠睪丸內(nèi)單倍體精子細(xì)胞和體外培養(yǎng)獲得的單倍體精子細(xì)胞行ROSI/ELSI后，，前者4-8細(xì)胞及桑囊胚形成率高于后者，但兩組間受精率、卵裂率及桑囊胚形成率均無(wú)顯著性差異。成熟精子ICSI的受精率、卵裂率、4-8細(xì)胞及桑囊胚形成率均顯著高于兩組ROSI。 結(jié)論：體外培養(yǎng)所獲單倍體精子細(xì)胞的受精能力與成年小鼠睪丸內(nèi)的精子細(xì)胞無(wú)顯著性差異，但前者的胚胎發(fā)育潛能略低于后者。成熟精子的顯微授精能力及胚胎發(fā)育潛能顯著高于兩組單倍體精子細(xì)胞。
[Abstract]:鐩殑錛氶

本文編號(hào)：1513186