本文關(guān)鍵詞： 人包皮成纖維細(xì)胞 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 慢病毒 飼養(yǎng)層　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的本研究建立原代培養(yǎng)人包皮成纖維細(xì)胞(human postnatal foreskin fibroblast hPFF)體系,絲裂霉素-C(Mitomycin C ,MMC)處理hPFF制備人體組織來源細(xì)胞飼養(yǎng)層;將分別表達(dá)Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4基因慢病毒顆粒感染hPFF,探討目的基因過表達(dá)慢病毒顆粒感染hPFF體外重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell iPSC)的關(guān)鍵技術(shù)。 方法(1)采用Ⅰ型膠原酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)hPFF,在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,以臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力、免疫細(xì)胞化學(xué)方法染色鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合法(Strept actividin-biotin complex SABC法)細(xì)胞鑒定。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl- trazolium bromide MTT法)測定細(xì)胞生長曲線。采用MMC處理hPFF制備細(xì)胞飼養(yǎng)層,MTT法篩選MMC作用的最佳濃度和時間(;2)將過表達(dá)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的空病毒顆粒感染hPFF,在熒光倒置顯微鏡下觀察感染效率及熒光表達(dá)情況,探索最佳感染條件及感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI值);(3)將生長狀態(tài)良好的hPFF隨機分為3組:陰性對照組、含綠色熒光蛋白空病毒感染組、目的基因感染組,采用含連續(xù)感染方式,在二次感染后4天給予hPFF干細(xì)胞培養(yǎng)條件,在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察其形態(tài)變化,拉曼光譜技術(shù)檢測三組細(xì)胞光譜,探索最佳培養(yǎng)條件。 結(jié)果(1)0.025%Ⅰ型膠原酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法可以在體外建立穩(wěn)定的hPFF系,培養(yǎng)5d時即有細(xì)胞游走出,細(xì)胞呈長梭形、核仁明顯,7d時有較多的細(xì)胞游離出,匯集成束,10d左右細(xì)胞鋪滿瓶底,0.25%胰蛋白酶消化傳代。免疫細(xì)胞化學(xué)法SABC法鑒定細(xì)胞呈陽性結(jié)果。絲裂霉素C 10μg/ml作用3.5h或15μg/ml作用2.5h能抑制hPFF增殖,細(xì)胞在1周內(nèi)維持穩(wěn)定的水平;(2)本實驗室培養(yǎng)條件下,慢病毒感染hPFF的最佳MOI值為40;(3)同等感染條件下,含綠色熒光蛋白空病毒感染組、陰性對照組的hPFF倒置顯微鏡下觀察形態(tài)未發(fā)生明顯改變,四個目的基因慢病毒混合感染組細(xì)胞偽足明顯收縮,形態(tài)由長梭形變?yōu)閳A形。拉曼光譜技術(shù)檢測也發(fā)現(xiàn)陰性對照組與含綠色熒光蛋白空病毒感染組光譜圖沒有明顯差異,目的基因組與陰性對照組有差異。 結(jié)論本研究成功地進(jìn)行了hPFF的原代培養(yǎng),體外建立穩(wěn)定的hPFF系,制備的人體組織來源的細(xì)胞飼養(yǎng)層;實驗表明慢病毒顆粒可成功感染hPFF,四個目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可誘導(dǎo)hPFF形態(tài)變化。
[Abstract]:Objective to establish a primary culture system of human postnatal foreskin fibroblast hPFF, and to prepare human tissue derived cell feeder layer by mitomycin C mitomycin C (MMC) treatment. The lentivirus particles expressing Oct4 / Sox2nc-Mycf4 gene were infected with lentivirus particles (hPFFs), and the reprogramming of lentivirus particles infected with lentivirus particles was studied as a key technique for inducing pluripotent stem cell (IP SCC) of pluripotent stem cells in vitro. Methods 1) hPFF was isolated by collagenase digestion and tissue mass culture. Cell growth was observed under inverted microscope and cell viability was detected by trypan blue staining. The cell growth curve was determined by strept actividin-biotin complex SABC method using strept actividin-biotin complex SABC method. The cell growth curve was determined by trimethylazolium microzyme reaction colorimetric method. The cell growth curve was determined by the method of 4-dimethylazolazolyl thiazol-2-ylthiazol-2-ylthiazol-2-diphenyl5-diphenyl- trazolium bromide MTT. The best concentration and time for screening the action of MMC by MMC treatment with hPFF was determined. The empty viral particles expressing green fluorescent protein (GFP) were infected with MMC, and the infection efficiency and fluorescence expression were observed under fluorescence inverted microscope. To explore the optimal infection conditions and the infection plural infection of moi, the hPFF with good growth state was randomly divided into three groups: negative control group, empty virus infection group containing green fluorescent protein, and target gene infection group, with continuous infection. HPFF stem cells were cultured 4 days after secondary infection. Morphological changes were observed dynamically under inverted microscope. Raman spectroscopy was used to detect the spectrum of three groups of cells and to explore the best culture conditions. Results A stable hPFF cell line could be established in vitro by collagenase digestion with 0.025% collagenase digestion and tissue mass culture. After 5 days of culture, the cells swam out, the cells were fusiform, and more cells were free from the nucleoli at 7 days. The cells were collected into bundles for about 10 days, the cells were filled with 0.25% trypsin digestion and passaged. The positive results were identified by immunocytochemistry SABC method. Mitomycin C 10 渭 g / ml could inhibit the proliferation of hPFF in 3.5 h or 15 渭 g / ml for 2.5 h, and the cell proliferation was inhibited by mitomycin C (10 渭 g / ml) or 15 渭 g / ml (2.5 h). The optimal MOI value of lentivirus infected with hPFF was 40 ~ 3) under the same infection condition, the group containing green fluorescent protein empty virus (GFP) was infected with green fluorescent protein (GFP). The morphology of the negative control group was not changed under inverted hPFF microscope, but the pseudopodia contracted significantly in the four target gene lentivirus mixed infection groups. Raman spectroscopy also showed that there was no significant difference between the negative control group and the green fluorescent protein empty virus infection group, but the target genome was different from the negative control group. Conclusion the primary culture of hPFF was successfully carried out in this study, and a stable hPFF line was established in vitro, and the human tissue derived cell feeder layer was prepared, and the results showed that lentivirus particles could be successfully infected with hPFF, and four target gene transduction could induce the morphological changes of hPFF.
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：1499245