發(fā)布時(shí)間：2018-02-09 18:37

  本文關(guān)鍵詞： 喉黏膜 間充質(zhì)干細(xì)胞 鑒定　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：隨著喉微創(chuàng)技術(shù)的應(yīng)用及普及,目前可以在顯微鏡下借助激光等手段切除聲帶早期病變,但病變切除的同時(shí),若造成了聲帶固有層的缺失,術(shù)后疤痕形成,就會(huì)影響患者的發(fā)音。聲帶疤痕已成為我們迫切需要改善并解決的一個(gè)重要問題。干細(xì)胞注射作為治療聲帶疤痕的一種新的治療手段,為我們帶來了希望。人們嘗試?yán)霉撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞、肌源性干細(xì)胞及脂肪基質(zhì)干細(xì)胞等不同的成體干細(xì)胞來治療聲帶疤痕,但是因?yàn)閼?yīng)用以上的干細(xì)胞存在著取材困難,細(xì)胞植入后形成的組織結(jié)構(gòu)差異大等缺點(diǎn),因此,目前還沒有發(fā)現(xiàn)理想的,令人滿意的干細(xì)胞治療手段。 近年來隨著干細(xì)胞研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)在成熟的高等動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在著間充質(zhì)干細(xì)胞,而且它們還參與了不同組織的形成與發(fā)展。因此,本研究的目的是為了確定聲帶固有層和會(huì)厭黏膜固有層中是否均存在著間充質(zhì)干細(xì)胞,并且通過MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法比較聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞和會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性,尋找一種能夠用于聲帶組織工程修復(fù)的理想的間充質(zhì)干細(xì)胞。 1目的 探討聲帶固有層和會(huì)厭黏膜固有層中是否存在間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSC),并對其進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定,比較其生物學(xué)特性,為喉部組織的創(chuàng)傷修復(fù)提供新的細(xì)胞來源。 2方法 2.1喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Laryngeal mucosa mesenchymal stem cells,LM-MSC)的分離培養(yǎng)及鑒定 2.1.1聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Vocal fold mesenchymal stem cells,VF-MSC)的分離培養(yǎng)及鑒定: 從喉癌手術(shù)患者術(shù)中切下的組織中獲取正常聲帶固有層,利用組織塊培養(yǎng)法獲得固有層來源的細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析,及利用成脂、成骨誘導(dǎo)液對其進(jìn)行多項(xiàng)分化能力的研究。 2.1.2會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Epiglottis mucosa mesenchymal stem cells,EP-MSC)的分離培養(yǎng)及鑒定: 從喉癌手術(shù)患者術(shù)中切下的組織中獲取正常會(huì)厭舌面黏膜,利用消化培養(yǎng)法獲得固有層來源的細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析,及利用成脂、成骨、成神經(jīng)誘導(dǎo)液對其進(jìn)行多項(xiàng)分化能力的研究。 2.2聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞與會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較 繪制細(xì)胞生長曲線比較hVF-MSC和hEP-MSC的生長增殖情況,采用平板克隆形成試驗(yàn),比較其克隆形成能力。取第4代正常的hVF-MSC和hEP-MSC貼壁培養(yǎng)后加入含有VitC的膜片培養(yǎng)液,培養(yǎng)2w后用顯微鑷將膜片撕下,置于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)至膜片縮成團(tuán)狀。將細(xì)胞團(tuán)移植于裸鼠皮下2w后取材,取材后行HE和免疫組化Vimentin染色,觀察細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的存活及生長情況。 2.3炎癥微環(huán)境對會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的影響 通過在培養(yǎng)液中加入IL-1β和TNF-α來模擬炎癥微環(huán)境。細(xì)胞被分為兩組,一組是加入炎癥因子的炎癥組,另一組是使用正常培養(yǎng)液的對照組。實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容包括:①M(fèi)TT試驗(yàn)觀察急性炎癥對細(xì)胞增殖的影響。②流式細(xì)胞儀測定誘導(dǎo)7天炎癥微環(huán)境對細(xì)胞凋亡和周期的影響。③實(shí)時(shí)定量PCR測定炎癥微環(huán)境對膠原相關(guān)基因表達(dá)的影響。 3結(jié)果 3.1喉黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 3.1.1聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定: 原代培養(yǎng)3d左右,細(xì)胞開始貼壁,成短梭形,貼壁24h細(xì)胞伸展成長梭形,形態(tài)類似成纖維細(xì)胞,但是胞突的形態(tài)更加細(xì)長,核較大,呈橢圓形。利用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析,hVF-MSC高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志(CD29-57.3%、CD44-99.1%、CD90-97%、CD105-26%、CD146-4.8%),不表達(dá)造血系(CD34-0.9%、CD45-0.4%)的表面標(biāo)志。在體外分別經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)分化后,油紅O染色陽性,茜素紅染色陽性。 3.1.2會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定: 原代培養(yǎng)3 d左右,細(xì)胞開始貼壁,成短梭形,貼壁24 h后細(xì)胞伸展成長梭形,形態(tài)類似成纖維細(xì)胞,核較大,呈橢圓形。利用流式細(xì)胞儀對其進(jìn)行表面標(biāo)志物的分析, hEP-MSC高表達(dá)間充質(zhì)的表面標(biāo)志(CD29-16.9%、CD44-97.4%、CD90-89.5%、CD105-85.9%、CD146-2.5%、stro-1-20.4%),不表達(dá)造血系(CD34-1.2%、CD45-0.8%)的表面標(biāo)志。在體外分別經(jīng)成脂、成骨和成神經(jīng)誘導(dǎo)分化后,油紅O染色陽性,茜素紅染色陽性,神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原S100呈陽性表達(dá)。 3.2繪制細(xì)胞生長曲線(MTT)可以觀察到在4至7天hVF-MSC較hEP-MSC 有較快的生長增殖速度(P0.05)。通過平板克隆形成試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)hVF-MSC較hEP-MSC具有更高的克隆形成能力(P 0.05),兩者均可以形成不同形態(tài)和大小的克隆。hVF-MSC和hEP-MSC均可成功的培養(yǎng)出膜片,裸鼠背部正中皮下體內(nèi)移植2w后取材。HE染色的結(jié)果顯示細(xì)胞在體內(nèi)生長良好且無炎癥反應(yīng),免疫組化Vimentin染色的結(jié)果可以觀察到細(xì)胞在體內(nèi)的分布情況,細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)清晰兩者沒有明顯的差異。 3.3炎癥微環(huán)境對會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的影響 MTT實(shí)驗(yàn)觀察急性炎癥對hEP-MSC生長增殖能力的影響。利用吸光值繪制生長曲線,比較hEP-MSC在炎癥和正常條件下培養(yǎng)5d細(xì)胞的增殖能力。炎癥組與正常組相比,增殖明顯加快(p0.05)。但誘導(dǎo)7天的細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示,炎癥組G0G1(69.55%)期較高,而S(29.0%)和G2M(1.45%)較對照組(S=29.4%, G2M=7.52%, G0G1=63.08%)低。炎癥7天可使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,降低S和G2/M期細(xì)胞比例,提示炎癥7天已經(jīng)開始抑制細(xì)胞的增殖,阻滯了細(xì)胞周期進(jìn)程,影響了其復(fù)制。細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)7天的結(jié)果顯示,炎癥組(2.5%)比正常組(1.7%)的凋亡比例更高。對炎癥誘導(dǎo)的hEP-MSC在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)(6h,12h,24h,48h)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測定,COL-1的表達(dá)量均下降,COL-3的表達(dá)量在24h內(nèi)下降,48h明顯上升。MMP-1的表達(dá)量在所有的時(shí)間點(diǎn)均上升(P 0.05)。 4結(jié)論 4.1本實(shí)驗(yàn)利用組織塊培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)鑒定了聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞,并證明了其具有向脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的能力。利用消化培養(yǎng)法成功地培養(yǎng)鑒定了會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞,并證明了其具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞與會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性比較神經(jīng)細(xì)胞分化的能力。 4.2聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞較會(huì)厭黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞有較快的生長增殖速度和較好的克隆形成能力。兩種細(xì)胞膜片裸鼠體內(nèi)移植的結(jié)果初步顯示,hVF-MSC和hEP-MSC均可用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn),且細(xì)胞可以在體內(nèi)正常生長,為hEP-MSC應(yīng)用于大型動(dòng)物的體內(nèi)試驗(yàn)提供了良好的證據(jù)。 4.3炎癥因子誘導(dǎo)早期,hEP-MSC的生長增殖能力與對照組相比明顯加快。誘導(dǎo)7天后,細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示炎癥可以導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡明顯增加,細(xì)胞周期的結(jié)果顯示炎癥可以導(dǎo)致細(xì)胞處于增殖期的數(shù)量減少。通過對炎癥誘導(dǎo)的hEP-MSC進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測定發(fā)現(xiàn),在炎癥的誘導(dǎo)下,48h時(shí)Col-1的表達(dá)量下降至最低,這將會(huì)影響后期聲帶修復(fù)所應(yīng)具有的正常的強(qiáng)度和韌性,而Col-3在48h時(shí)的表達(dá)量過高也不利于聲帶恢復(fù)其正常的粘彈性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：1498593