本文關(guān)鍵詞： 甲型流感病毒 季節(jié)性流感疫苗 廣譜流感疫苗 免疫保護(hù)效果評價　出處：《中國疾病預(yù)防控制中心》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：廣譜流感疫苗的研究對流感大流行的防控具有重要意義。十幾年來,廣譜流感疫苗的研究取得了明顯進(jìn)展。其中,基于流感病毒核蛋白(Nucleoprotein, NP)與基質(zhì)蛋白2胞外區(qū)(Matrix protein 2 ectodomain, M2e)多肽的多種廣譜流感疫苗在動物研究中顯示了較好的免疫保護(hù)效果。鑒于大腸桿菌發(fā)酵工藝成熟,表達(dá)效率高,綜合成本低等優(yōu)勢,使用原核表達(dá)的NP與M2e作為疫苗的靶抗原已成為廣譜流感疫苗研究的重要方向。由于原核表達(dá)的NP與M2e誘發(fā)的保護(hù)性免疫反應(yīng)較弱,又不能直接采用季節(jié)性流感疫苗血凝抑制(Hemagglutinin inhibition, HI)抗體滴度的免疫指標(biāo)進(jìn)行評價,因此,選擇有效的疫苗靶抗原和佐劑以增強(qiáng)其免疫保護(hù)效果,建立合理的疫苗免疫保護(hù)評價體系,對疫苗的免疫保護(hù)效果進(jìn)行科學(xué)評價,已成為這類廣譜流感疫苗臨床前研究需要解決的關(guān)鍵問題。為此,本研究在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)NP及NP與M2e融合蛋白(NM2e)的基礎(chǔ)上,對上述問題進(jìn)行了深入研究。首先對NP與NM2e蛋白亞單位疫苗在BALB/c小鼠中的保護(hù)效果進(jìn)行了比較,并研究了Al(OH)3、CpG及Al(OH)3+CpG對NP與NM2e疫苗保護(hù)效果的影響,以確定用于廣譜流感疫苗研發(fā)的靶抗原與佐劑；其次,鑒于季節(jié)性流感疫苗在人群中誘發(fā)HI抗體滴度到達(dá)40(HI=40)是國際公認(rèn)的疫苗有效性指標(biāo),本研究提出以季節(jié)性流感疫苗HI=40對應(yīng)的同型同株、同型異株、異型異株流感病毒的攻擊劑量來評價基于NP與M2e的廣譜流感疫苗的保護(hù)效果,即,建立以季節(jié)性流感疫苗為參考的免疫保護(hù)效果評價體系；第三,使用該評價體系,從疫苗交叉免疫保護(hù)效果、免疫保護(hù)持續(xù)時間、免疫劑量和免疫程序?qū)γ庖弑Ｗo(hù)效果影響等方面對該疫苗進(jìn)行全面評價,以便為基于NP與M2e的廣譜流感疫苗臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：1、確定了以原核表達(dá)的NM2e融合蛋白為靶抗原的廣譜流感疫苗研發(fā)路線。在BALB/c小鼠中進(jìn)行的比較研究表明,NP蛋白僅能誘發(fā)良好的體液免疫反應(yīng)(106),NM2e融合蛋白除能誘發(fā)良好的針對NP的體液免疫反應(yīng)外,還能誘發(fā)一定強(qiáng)度的針對M2e的體液免疫反應(yīng)(102)；加入AI(OH)3和Al(OH)3+CpG佐劑均能使M2e體液免疫反應(yīng)增強(qiáng)至104,并能使NP (NP55-69)和M2e特異性細(xì)胞免疫由50提高至-200(SFC/106SMNC);使用20LD50 PR8流感病毒攻擊,10μg無佐劑NM2e的保護(hù)效果(27%)略優(yōu)于NP(13%),加入A1(OH)3、CpG或Al(OH)3+CpG佐劑均能分別有效增強(qiáng)NP(47%、27%、80%)與NM2e (93%、40%、100%)的保護(hù)效果,其中,NM2e的保護(hù)效果(93%)明顯優(yōu)于NP(47%);NM2e的保護(hù)效果與M2e特異性體液細(xì)胞免疫及NP55-69特異性細(xì)胞免疫正相關(guān)。鑒于Al(OH)3是一種成功的人用疫苗佐劑,本研究確定了以原核表達(dá)的NM2e融合蛋白為靶抗原,以Al(OH)3為佐劑的廣譜流感疫苗研發(fā)路線。2、建立了以季節(jié)性流感疫苗為參考的免疫保護(hù)評價體系。挑選了5株流感病毒進(jìn)行鼠肺傳代適應(yīng),獲得了3株鼠肺適應(yīng)株：與目前H1N1疫苗株同型匹配的兩株A1-P5-E1(H1N1)和GD-P40-E1 (H1N1),異型不匹配的一株A3J-P5-E1 (H3N2);通過對季節(jié)性流感疫苗在小鼠中的免疫原性、抗體動力學(xué)及免疫保護(hù)效力研究,確定了季節(jié)性流感疫苗在小鼠中HI=40的HA免疫劑量為1.5μg,該免疫劑量可百分之百保護(hù)小鼠抵御高至1000LD50同型同株流感病毒的攻擊,但卻不能保護(hù)小鼠抵御低至3LD50同型異株及異型異株流感病毒的攻擊。鑒于流感病毒在小鼠中1個LD50劑量(103-104TCID50)是在人群中飛沫傳播感染劑量(102TCID50)的10-100倍,綜合分析上述結(jié)果,確定了以季節(jié)性流感疫苗1.5μg HA免疫為參考,以同型同株、同型異株和異型異株病毒為攻擊毒株,以3-1000LD50病毒劑量進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)的免疫保護(hù)評價體系。3、完成了對NM2e廣譜流感疫苗免疫保護(hù)效果的評價。使用上述評價體系,對NM2e+Al(OH)3疫苗的免疫保護(hù)效果研究表明,H1N1季節(jié)性流感疫苗1.5μg HA可以分別百分之百保護(hù)小鼠抵御100LD50及300LD50同型匹配毒株A1-P5-E1(H1N1)與GD-P40-E1(H1N1)的攻擊,但不能保護(hù)低至3LD50同型異株P(guān)R8(H1N1)和5LD50異型異株A3J-P5-E1(H3N2)的攻擊(與對照組0%-33%無明顯差異)。NM2e+Al(OH)3疫苗的2.5μg、5μg、10μg3個免疫劑量均能保護(hù)50%以上小鼠抵御上述病毒攻擊,其中10gg劑量的保護(hù)效果最好,對20LD50PR8、100 LD50 A1-P5-E1、300 LD50 GD-P40-E1及30LD50A3J-P5-E1流感病毒攻擊后小鼠的保護(hù)率分別為100%、100%、50%和67%,具有良好的廣譜交叉免疫保護(hù)效果,抵御同型異株(A3J-P5-E1)及異型流感病毒(PR8)的效果明顯優(yōu)于季節(jié)性流感疫苗：在抗體動力學(xué)研究基礎(chǔ)上,采用兩針(0,14)與三針(0,14,28)免疫程序,NM2e+Al(OH)3疫苗10μg免疫小鼠后的2周、2月和6月均分別可保護(hù)90%、70%和50%小鼠抵御20LD50 PR8攻擊,免疫保護(hù)持續(xù)時間可長達(dá)至少6個月；使用兩針免疫程序(0,28), NM2e中試產(chǎn)品10μg、30μg和90μg的免疫反應(yīng)與保護(hù)效果與實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品一致。上述資料為該疫苗的臨床研究提供了重要參考。上述研究結(jié)果表明,原核表達(dá)的NM2e融合蛋白加Al(OH)3佐劑可作為廣譜流感疫苗研發(fā)的技術(shù)路線；以季節(jié)性流感疫苗為參考的免疫保護(hù)效果評價體系可用于評價基于甲型流感病毒NP與M2e的廣譜流感疫苗臨床前研究的免疫保護(hù)效果；本研究提供的疫苗免疫劑量、免疫程序及相應(yīng)的免疫保護(hù)資料,對該疫苗的臨床研究具有重要參考價值。
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【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392
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本文編號：1492397