本文關鍵詞： 重組雞痘病毒疫苗 新城疫 傳染性法氏囊病 口蹄疫 實驗免疫　出處：《吉林大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一種禽類動物的烈性傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經濟損失。疫苗接種是特異性預防和控制ND的可靠和有效的手段。雞傳染性法氏囊�。↖nfectious Bursal Disease，IBD）又稱甘波羅病，是由呼腸弧病毒引起的一種急性、高度傳染性疾病。由于該病發(fā)病突然、病程短、死亡率高，且可引起雞體免疫抑制，是危害當前養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病。近年來，各地出現超強毒株（vvIBDV）及變異株，并能突破母源抗體的保護，給IBD的防制帶來了巨大的困難。這兩種病毒病常規(guī)滅活苗免疫原性低，弱毒疫苗存在易散毒、毒力返強等缺陷，因此，研究新型疫苗已經成為當前的熱點。 口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouthdisease virus，FMDV）引起偶蹄動物感染的烈性傳染病之一。目前FMD呈世界范圍流行趨勢，其血清型有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型共7種。O型、Asia1型等FMD在我國周邊國家或東南亞地區(qū)時有發(fā)生，對我國養(yǎng)殖業(yè)構成了嚴重的威脅。 使用重組雞痘病毒誘導雞和哺乳動物細胞免疫應答抵抗外來抗原已經取得明顯進步，雞痘病毒的主要優(yōu)勢在于它允許插入較大量的外源基因。需要我們明確的是對于任何一種病毒表達哪些基因用作多價抗原。使用天然的雞痘病毒啟動子可能優(yōu)化外源抗原的表達。也要對重組雞痘病毒表達抗原（外源抗原或雞痘病毒抗原）之間的競爭進行更多的認識，從而幫助構建有效預防多種病原體的多價重組體雞痘病毒。聯(lián)合免疫的深入研究有助于幫助我們認識進而選擇不同疫苗形式（包括DNA、蛋白和傳統(tǒng)的疫苗）的最佳組合。 本實驗以合成的痘病毒早晚期啟動子PE/L及P7.5作為串聯(lián)啟動子的具有自主產權的雞痘病毒轉移載體為基礎，選擇NDV的F、HN基因，IBDV的VP0（VP243）、VP2基因，分別置于雙向啟動子下游，構建了雙向表達的雞痘病毒轉移載體pMTB18-F-F、pMTB18-F-HN、pMTB18-F-VP0、pMTB18-VP0-VP2、pUTAL-F-VP2。應用脂質體轉染法，將該重組雞痘病毒中間轉移載體與282E4株雞痘病毒共轉染雞胚成纖維細胞(CEF)，經BrdU連續(xù)三次加壓篩選，挑斑純化后傳代，對雞痘病毒重組體在體外分別以PCR、RT-PCR和IFA對外源基因的重組、轉錄和蛋白表達及其生物學活性進行了鑒定。PCR檢測結果表明轉移載體構建均正確，同時在轉錄水平上進一步證實了重組病毒可以穩(wěn)定攜帶外源基因并正確轉錄。將重組雞痘病毒rFPV-F-VP0、rFPV-F-F、rFPV-F-HN、rFPV-F-VP2以抗NDV血清作為一抗，rFPV-F-VP0、rFPV-VP0-VP2、rFPV-F-VP2以抗IBDV血清作為一抗分別進行間接免疫熒光和免疫酶檢測，分別檢測到了特異性熒光和褐色的痘斑。研究證明獲得了5株重組雞痘病毒rFPV，能夠有效的表達外源蛋白，表達產物具有相應的生物學活性。 以SPF雞作為動物模型，對之前構建的5株重組雞痘疫苗進行了免疫研究，通過體液與細胞免疫指標檢測，對疫苗的免疫原性進行了評估。結果顯示，所構建的重組雞痘病毒rFPV均能刺激SPF雞產生抗NDV或IBDV的特異性ELISA抗體，疫苗接種后第2周抗體水平開始逐漸提高，在第5-6周達到高峰，其抗體水平均高于對照組。對脾T淋巴細胞的增殖能力和血清中Th1類細胞因子（IFN-γ和IL-2）、Th2類細胞因子（IL-4和IL-10）進行了檢測。研究表明，重組雞痘疫苗使SPF雞產生了特異性體液和細胞免疫應答。攻毒試驗結果顯示，用重組雞痘病毒rFPV-F-HN能在一定程度上抵抗新城疫強毒的攻擊；重組雞痘病毒rFPV-F-VP2、rFPV-VP0-VP2免疫的SPF雞能夠明顯降低分離株IBDV-JL01/2007對法氏囊組織的損傷程度。 本實驗室先后成功構建并篩選出FMDV vUTAL3CP1（O型）、vUTAL-P1-2A-3C-IL18（Asia1型）、 vUTA2-P1-2A-3C （Asia1型）、vUTA2-P1-2A-IL18（O型）重組雞痘病毒疫苗， FMDVGS115/pPIC9K-VP1-2A-CTE（O型）、GS115/pPIC9K-VP1-2A-CTE（Asia1型）酵母重組表達蛋白，pVIRIL18P1（O型）和pVAXI-P1-2A-3C（Asia1型）核酸疫苗。上述疫苗經小鼠單獨免疫試驗，表明均具有良好的免疫原性，可以激發(fā)針對FMDV的特異性體液和細胞免疫應答。據此，本研究利用上述疫苗，采用prime-boost策略免疫FMDV敏感動物豚鼠，并對其誘導的特異性體液和細胞免疫水平進行了檢測，以此確定最佳疫苗和免疫策略。結果顯示，O型疫苗中，核酸苗pVIRIL18P1首免，重組雞痘病毒疫苗加強免疫的體液和細胞效果最好，Asia1型以重組雞痘苗vUTA2-P1-2A-3C-IL18細胞免疫效果突出。研究表明，在針對目標抗原的初次免疫反應中DNA免疫是最有效的，重組痘病毒可加強免疫。同時能依靠能痘病毒自身佐劑的活性增強免疫反應。 以豬為動物模型，應用prime-boost策略，評價了O型苗pVIRIL18P1/vUTAL3CP1、 vUTAL3CP1/vUTAL3CP1， Asia1型苗pVAXI-P12A3C/vUTA2-P12A3CIL18、vUTA2-P12A3CIL18/vUTA2-P12A3CIL18幾種聯(lián)合免疫方案的特異性體液和細胞免疫應答水平。核酸苗（500μg/頭）采用殼聚糖包裹，雞痘苗（107PFU）加入佐劑QS-21后與凍干保護劑混合。對35日齡仔豬間隔28d進行兩次免疫，應用O型和Asia1型口蹄疫間接ELISA、LPB-ELISA、VP1結構蛋白抗體ELISA（O型）、ELISPOT、T淋巴細胞增殖試驗、細胞因子檢測等試驗方法，證實了候選DNA和雞痘重組疫苗均能誘導特異性的免疫應答。核酸苗首免，重組雞痘病毒疫苗加強免疫的體液和細胞效果最優(yōu)�？傊狙芯恳孕碌妮d體構建和聯(lián)合免疫研究思路，，探討了重組雞痘病毒在雞新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、口蹄疫病毒新型疫苗的設計和免疫策略，對基于雙向啟動子的重組核酸疫苗構建與實驗免疫進行了深入研究，為有效禽類和哺乳動物重組疫苗的研制與臨床前實驗研究奠定了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張?zhí)靿q,廖延雄,劉堯服;口蹄疫乳鼠毒在蚯蚓和蒼蠅中實驗性帶毒[J];病毒學報;1991年03期

2 金華利,張富春 ,單文娟,張愛蓮,李軼杰,王賓;口蹄疫病毒VP1蛋白在酵母中的表達及免疫原性分析[J];細胞與分子免疫學雜志;2004年05期

3 熊光明;口蹄疫病毒和豬腸道病毒基因重組獲得的c731重組株的進一步研究[J];病毒學報;1987年01期

4 祝秀梅;慕洪濤;王凡;呂志慧;馬全英;劉學榮;黃銀君;黃安倉;牟克斌;;整聯(lián)蛋白與口蹄疫病毒感染[J];現代生物醫(yī)學進展;2009年15期

5 趙凱,鄒仕平,張震宇,鄭兆鑫,徐泉興,尤永進,朱彩珠,馮霞;抗O型口蹄疫病毒DNA疫苗的建立[J];中國免疫學雜志;2002年02期

6 趙凌,熊濤,畢丁仁;重組痘苗病毒誘導的抗口蹄疫病毒的保護性免疫力[J];國外醫(yī)學.預防.診斷.治療用生物制品分冊;2001年01期

7 蘇衛(wèi),石世匡,徐維佳,王濤,張曉丁,牛紅衛(wèi);應用聚合酶鏈反應檢測口蹄疫病毒的實驗研究[J];病毒學報;1993年04期

8 徐冰;食用疫苗[J];國外醫(yī)學.預防.診斷.治療用生物制品分冊;1995年05期

9 張洪勇,金寧一;口蹄疫新型疫苗的研究進展[J];中國生物制品學雜志;2003年03期

10 潘麗,張永光,王永錄,王寶琴,王文秀,方玉珍,蔣守田,張維德,董金杰,呂建亮,謝慶閣;口蹄疫病毒O/China/99株多基因植物組成型表達載體的構建及序列分析[J];中國人獸共患病雜志;2005年10期

相關會議論文 前10條

1 韓四娥;李培利;楊麗;云夢娜;;BHK_(21)細胞與乳鼠滴定FMD病毒效價的重復性對比試驗[A];中國畜牧獸醫(yī)學會生物制品學分會中國微生物學會獸醫(yī)微生物學專業(yè)委員會2010年學術年會（第三屆中國獸藥大會學術論壇）論文集[C];2010年

2 卜春玲;羅滿林;劉鎮(zhèn)明;黃毓茂;賀東生;;重組偽狂犬病毒(PRV)TK~-/FMDV VP1的構建[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立20周年慶典暨第十次學術研討會論文集（上）[C];2003年

3 朱遠茂;高欲燃;于作;董秀梅;呂闖;薛飛;;表達FMDV Asia 1 VP1基因重組BHV-1的構建[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第八次學術研討會論文集[C];2010年

4 李昌;金寧一;王罡;王萍;張洪勇;鄭敏;季靜;尹革芬;余云舟;;口蹄疫病毒P1全長基因表達載體的構建及對馬鈴薯的轉化[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

5 王輝;柳紀省;王新宇;;牛源O型口蹄疫病毒(FMDV)人工致弱株OMⅢ全基因組測序及其基因變異的研究[A];中國的遺傳學研究——中國遺傳學會第七次代表大會暨學術討論會論文摘要匯編[C];2003年

6 尹革芬;金寧一;張洪勇;葛淑敏;鄭敏;王振國;秦曉冰;李萍;;FMDV結構蛋白基因VP1與白介素18聯(lián)合基因免疫[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

7 馬鳴瀟;金寧一;王振國;鄭敏;尹革芬;金擴世;夏志平;;共表達H5N1、H7N1亞型AIV HA與雞IL-18多價重組雞痘病毒免疫保護性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2004學術年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學術研討會論文集（下冊）[C];2004年

8 張洪勇;金寧一;葛淑敏;尹革芬;馬鳴瀟;李子健;江文正;;共表達FMDV P1-2A和3C重組雞痘病毒疫苗與核酸疫苗的實驗免疫研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2004學術年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學術研討會論文集（下冊）[C];2004年

9 魯會軍;韓松;金寧一;;口蹄疫診斷方法研究進展[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

10 邵軍軍;�；菔|;林彤;叢國正;獨軍政;謝慶閣;;用原位雜交對BHK-21細胞中的FMDV定位和檢測[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2006學術年會論文集（上冊）[C];2006年

相關重要報紙文章 前1條

1 張永光 研究員;全球口蹄疫疫情警報聲聲急[N];中國畜牧報;2004年

相關博士學位論文 前10條

1 朱戰(zhàn)波;表達NDV、IBDV及FMDV基因的重組FPV載體活疫苗構建和實驗免疫研究[D];吉林大學;2012年

2 熊義;IRES調控α-干擾素的抗FMDV研究[D];武漢大學;2009年

3 郭慧琛;O型口蹄疫病毒多基因DNA疫苗的研制[D];中國農業(yè)科學院;2004年

4 胡博;Asia 1型、O型FMDV復合多表位口服疫苗構建與實驗免疫研究[D];吉林大學;2010年

5 史喜菊;牛IFN-α/γ基因的克隆、表達及重組蛋白的應用研究[D];中國農業(yè)大學;2004年

6 白興文;我國O型泛亞1系口蹄疫病毒表型差異的分子基礎[D];中國農業(yè)科學院;2012年

7 吳艷濤;新城疫病毒F48E8株融合蛋白基因和表達該基因的重組雞痘病毒[D];揚州大學;2000年

8 邵寒娟;A、O型口蹄疫雙價疫苗研究[D];廈門大學;2004年

9 邵衛(wèi)星;分別表達雞白細胞介素1β、白細胞介素2和骨髓單核細胞生長因子基因重組雞痘病毒的構建及其對ND疫苗免疫效力的影響[D];揚州大學;2004年

10 王開宇;口蹄疫基因工程疫苗免疫效果的評價與機制研究[D];第二軍醫(yī)大學;2008年

相關碩士學位論文 前10條

1 盧國棟;Asia1型FMDV感染BHK-21細胞蛋白質組學研究[D];中國農業(yè)科學院;2012年

2 薛霜;綿羊FMDV受體整聯(lián)蛋白αvβ6的體外表達及組織分布研究[D];甘肅農業(yè)大學;2010年

3 陳秋菊;FMDV 2A介導的乳腺上皮細胞雙基因表達載體構建及表達[D];西北農林科技大學;2011年

4 劉永杰;Asia1型FMDV前導蛋白的BHK-21亞細胞定位及其所致細胞蛋白質組變化研究[D];甘肅農業(yè)大學;2011年

5 黃立軍;口蹄疫病毒在豬體內的定位研究[D];甘肅農業(yè)大學;2004年

6 崔力凡;抗FMDV核酶的篩選及其重組成纖維細胞株的建立[D];中國農業(yè)科學院;2011年

7 楊雙;A型FMDV感染BHK-21細胞差異表達基因的篩選和初步分析[D];中國農業(yè)科學院;2011年

8 焦同路;表達H5亞型禽流感病毒HA蛋白的重組禽痘病毒的構建及其免疫效力初評[D];中國農業(yè)科學院;2012年

9 胡成玉;O型FMDV多抗原表位基因克隆、表達及其免疫原性研究[D];湖南農業(yè)大學;2012年

10 王春奕;抗原捕獲反轉錄聚合酶鏈式反應（AC-RT/PCR）檢測口蹄疫病毒方法的建立[D];甘肅農業(yè)大學;2004年

本文編號：1492250