本文關(guān)鍵詞： 高遷移率族蛋白B1 調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞 膿毒癥 脾T淋巴細(xì)胞 白介素-2 白介素-10 白介素-12 Toll樣受體4 增殖反應(yīng) 功能性極化　出處：《中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為一種晚期炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)了膿毒癥和其他全身炎癥的致死性效應(yīng)，研究其病理生理作用與意義將有助于深化對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并為免疫反應(yīng)的調(diào)控提供潛在的干預(yù)目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)擬采用HMGB1體外刺激小鼠脾臟調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（DCreg），重點(diǎn)圍繞HMGB1對(duì)DCreg免疫功能的影響及其受體機(jī)制進(jìn)行初步探討，旨在為膿毒癥及多器官功能障礙綜合征的預(yù)防和治療提供新思路。 方法：1.分離培養(yǎng)正常Balb/c小鼠脾臟DCreg（CD11c~(low)CD45RB~(high)DCs），采用不同劑量的HMGB1（10、100、1000ng/ml）刺激12小時(shí)，并以100ng/ml HMGB1于不同時(shí)間點(diǎn)（2、12、24小時(shí)）刺激，觀察HMGB1刺激與DCreg分泌白細(xì)胞介素（IL）-10和IL-12水平、表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和主要組織相容性復(fù)合物（MHC）-II表達(dá)的劑量-效應(yīng)關(guān)系及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。采用ELISA法檢測上清中IL-10和IL-12水平，DCreg共刺激分子表達(dá)采用流式細(xì)胞儀分析。2. DCreg經(jīng)100ng/ml的HMGB1刺激12小時(shí)后，與脾T淋巴細(xì)胞以1:100的細(xì)胞比例混合培養(yǎng)，于共同作用后3天觀察T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、功能性極化（Th1/Th2）、IL-2表達(dá)情況。3. HMGB1刺激后，分別采用流式細(xì)胞術(shù)和PCR技術(shù)檢測DCreg表面Toll樣受體（TLR）4的表達(dá)，進(jìn)一步觀察封閉TLR4受體對(duì)HMGB1刺激后DCreg分泌IL-10和IL-12水平、以及對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、功能性極化、IL-2表達(dá)的影響。 結(jié)果：1. HMGB1對(duì)小鼠脾臟DCreg功能的影響：（1）HMGB1刺激后，DCreg分泌IL-10、IL-12水平于12~24小時(shí)分別明顯升高和下降（P0.01），，其中以作用12小時(shí)后達(dá)穩(wěn)態(tài)；10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的HMGB1刺激均可誘導(dǎo)DCregIL-10、IL-12分泌水平分別明顯上升和下降（P0.01），其中HMGB1的濃度為100ng/ml時(shí)，DCreg分泌IL-10、IL-12趨于穩(wěn)定。（2）與正常對(duì)照組相比，100ng/ml的HMGB1刺激DCreg12小時(shí)后，表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-II表達(dá)均明顯下調(diào)（P0.01）。2. HMGB1誘導(dǎo)的DCreg對(duì)小鼠脾T淋巴細(xì)胞功能的影響：HMGB1誘導(dǎo)的DCreg與T淋巴細(xì)胞以1:100的比例相互作用3天，與對(duì)照組比較，T淋巴細(xì)胞對(duì)絲裂原刺激的增殖反應(yīng)明顯減弱，上清液中干擾素（IFN）-γ/IL-4比值顯著降低，IL-2水平明顯降低（P0.01）。3. HMGB1介導(dǎo)小鼠脾臟DCreg作用的受體機(jī)制：（1）100ng/ml HMGB1刺激12小時(shí)后，DCreg表面TLR4表達(dá)顯著上調(diào)（P0.01）；（2）拮抗TLR4后，HMGB1刺激的DCreg分泌IL-10、IL-12水平與對(duì)照組比較變化不明顯，T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、功能性極化、IL-2水平亦未見顯著改變（P0.05）。 結(jié)論：1. HMGB1能促進(jìn)IL-10的合成、釋放增加，抑制IL-12的合成、釋放，誘導(dǎo)DCreg表面共刺激分子表達(dá)減弱，HMGB1可能是誘導(dǎo)DCreg功能分化的重要免疫刺激信號(hào)。2. HMGB1誘導(dǎo)的DCreg使脾T淋巴細(xì)胞對(duì)絲裂原刺激的增殖反應(yīng)明顯抑制，并促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th2功能性極化，抑制IL-2的合成、釋放。3. HMGB1能上調(diào)DCreg受體TLR4表達(dá)，TLR4可能是參與HMGB1誘導(dǎo)DCreg功能分化的主要受體之一。
[Abstract]:Objective: as a late inflammatory mediator, high mobility group protein B1HMGB1 mediates the lethal effect of sepsis and other systemic inflammation. The study of its pathophysiological role and significance will help to deepen the understanding of the pathogenesis of sepsis. In this experiment, HMGB1 was used to stimulate mouse splenic regulatory dendritic cells in vitro. The effect of HMGB1 on the immune function of DCreg and its receptor mechanism were discussed in order to provide new ideas for the prevention and treatment of sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Methods 1. The spleen of normal Balb/c mice was isolated and cultured. Different doses of HMGB1 / 100ng / ml were used to stimulate for 12 hours, and 100ng / ml HMGB1 was used at different time points. The levels of IL-10 and IL-12 secreted by HMGB1 and DCreg were observed, and the surface costimulatory molecules CD40 and CD80 were observed. The dose-effect relationship and time-effect relationship of the expression of CD86 and MHC-II. The levels of IL-10 and IL-12 in the supernatant were detected by ELISA method. The expression of DCreg costimulatory molecules was analyzed by flow cytometry. DCreg was stimulated by 100ng / ml HMGB1 for 12 hours. After co-culture with spleen T lymphocytes at 1: 100, T lymphocyte proliferation and functional polarization Th1 / Th2 were observed 3 days after co-treatment. After HMGB1 stimulation, the expression of Toll like receptor (TLR4) on the surface of DCreg was detected by flow cytometry and PCR. The levels of IL-10 and IL-12 secreted by DCreg stimulated by HMGB1, the proliferation response of T lymphocytes and the functional polarization of T lymphocytes were further observed by blocking TLR4 receptor. The effect of IL-2 expression. Results 1. The effect of HMGB1 on the function of DCreg in the spleen of mice. IL-10 was secreted by HMGB1 stimulated by HMGB1. The level of IL-12 increased and decreased significantly at 12h after 24 hours, and reached steady state after 12 hours of exposure. 10ng / ml 100ng / ml HMGB1 stimulation could induce DCregIL-10. The level of IL-12 secretion was increased and decreased significantly (P 0.01), and IL-10 was secreted when the concentration of HMGB1 was 100ng / ml. Compared with the control group, the surface costimulatory molecule CD40 and CD80 were stimulated by 100ng / ml HMGB1 for DCreg12 hours. The expression of CD86 and MHC-II were significantly down-regulated (P0.01). Effect of DCreg induced by HMGB1 on the function of spleen T lymphocytes in mice; the ratio of 1: 100 of DCreg to T lymphocytes induced by 1: HMGB1 interacted for 3 days. Compared with the control group, the proliferative response of T lymphocytes to mitogen stimulation was significantly decreased, and the ratio of IFN- 緯 / IL-4 in the supernatant was significantly decreased. The level of IL-2 decreased significantly. The receptor mechanism of HMGB1 mediated the effect of DCreg in spleen of mice was induced by 100 ng / ml HMGB1 for 12 hours. The expression of TLR4 on the surface of DCreg was significantly upregulated (P 0.01). (2) the level of IL-10 IL-12 secreted by DCreg stimulated by HMGB1 after TLR4 was not significantly changed compared with the control group. There was no significant change in IL-2 level. Conclusion 1. HMGB1 can promote the synthesis of IL-10, increase its release, inhibit the synthesis of IL-12, and induce the decrease of the expression of costimulatory molecules on the surface of DCreg. HMGB1 may be an important immunostimulatory signal to induce the differentiation of DCreg. 2. DCreg induced by HMGB1 can significantly inhibit the proliferation of splenic T lymphocytes to mitogen stimulation. It also promoted T lymphocytes to functional polarization of Th2, inhibited the synthesis of IL-2, and released .3.The expression of DCreg receptor TLR4 was up-regulated by HMGB1. TLR4 may be one of the major receptors involved in DCreg differentiation induced by HMGB1.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1489617