本文關(guān)鍵詞： 鈣網(wǎng)蛋白 多聚體 巨噬細(xì)胞 內(nèi)毒素 免疫原性　出處：《蘇州大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，由Thomas J. Ostwald等1974年首次從兔的基質(zhì)網(wǎng)中分離出來。CRT是一個(gè)酸性的Ca2+結(jié)合蛋白，分子量約為46kD，分為N、P、C三個(gè)結(jié)構(gòu)域。N和P連接部位為該蛋白發(fā)揮分子伴侶功能的重要區(qū)域，C端是一個(gè)酸性結(jié)構(gòu)區(qū)域，結(jié)合有大量的Ca2+，被譽(yù)為細(xì)胞內(nèi)的“鈣庫”。近年來的研究表明，CRT還存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外并發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能，諸如參與適應(yīng)性免疫的抗原加工和遞呈、抗腫瘤免疫應(yīng)答、介導(dǎo)凋亡細(xì)胞的吞噬、細(xì)胞的粘附和遷移以及免疫細(xì)胞的增殖和活化等。 為了進(jìn)一步研究CRT的免疫生物學(xué)活性，我們以新鮮鼠肝作為原材料，利用硫酸銨沉淀和DEAE陰離子交換層析等方法從收集的鼠肝細(xì)胞中純化得到天然鈣網(wǎng)蛋白（Native calreticulin, N-CRT）。同時(shí)，我們還利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)了重組鈣網(wǎng)蛋白（Recombinant calreticulin, rCRT）,并用Ni+柱對其進(jìn)行純化，得到了較高純度的蛋白。因?yàn)閞CRT存在較大量多聚體的情況，我們利用凝膠過濾的方法對其進(jìn)行了分離，得到了rCRT多聚體（PrCRT）， rCRT單體Ⅰ（MrCRTⅠ），rCRT單體Ⅱ（MrCRTⅡ）等三個(gè)組分。在此基礎(chǔ)上，我們對上述幾種成分刺激腹腔巨噬細(xì)胞(PMC)的活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)rCRT和PrCRT具有很強(qiáng)的刺激細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α和IL-6的活性，而N-CRT、MrCRTⅠ和MrCRTⅡ的活性則相對較弱。鑒于多聚體強(qiáng)烈的功能可能受到原核表達(dá)系統(tǒng)中內(nèi)毒素的污染，我們利用N-CRT研究了其與LPS可能存在的協(xié)同刺激活性。結(jié)果表明，N-CRT不能和LPS結(jié)合，也不具有協(xié)同增強(qiáng)LPS活性的功能。 我們還利用N-CRT，，rCRT，PrCRT，MrCRTⅠ，MrCRTⅡ分別免疫了C57BL/6小鼠，分析其刺激小鼠產(chǎn)生抗體的情況。結(jié)果表明，N-CRT，MrCRTⅠ，MrCRTⅡ均不能免疫小鼠產(chǎn)生特異性的抗體，而rCRT和PrCRT均能產(chǎn)生高滴度的特異性抗體。 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)CRT具有刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥因子的功能，并且PrCRT具有很強(qiáng)刺激功能，這種功能與LPS沒有直接關(guān)系，在小鼠免疫試驗(yàn)中也證實(shí)了這一結(jié)果。鼠源的N-CRT以及rCRT單體免疫小鼠均不能產(chǎn)生特異性的抗體，而多聚體則具有極強(qiáng)的免疫原性。這些發(fā)現(xiàn)為我們進(jìn)一步研究CRT的生物學(xué)活性提供了有價(jià)值的線索。
[Abstract]:Calreticulinine (CRT) is a kind of endoplasmic reticulum protein. In 1974, Thomas J. Ostwald was isolated from rabbit matrix network for the first time. CRT is an acidic Ca2 binding protein with a molecular weight of about 46kD and is divided into N. The three domains. N and P junctions are the important regions in which the protein performs molecular chaperone function. The C-terminal of the protein is an acidic structural region, which binds a large number of Ca2. Recent studies have shown that CRT also exists outside the endoplasmic reticulum and plays an important biological role, such as antigen processing and presentation of adaptive immunity. Antitumor immune response mediates phagocytosis of apoptotic cells adhesion and migration of cells proliferation and activation of immune cells. In order to further study the immunobiologic activity of CRT, we used fresh rat liver as raw material. Native calreticulin was purified from rat hepatocytes by ammonium sulfate precipitation and DEAE anion exchange chromatography. At the same time, we also expressed Recombinant calreticulin (rCRT) with Escherichia coli system. High purity protein was obtained by using Ni column to purify the protein. Because of the existence of a large number of polymers in rCRT, we used gel filtration method to separate the protein. Three components of rCRT polymer PrCRT, rCRT monomer 鈪

本文編號：1471891