本文關(guān)鍵詞： 丙型病毒性肝炎 水動(dòng)力轉(zhuǎn)染 優(yōu)化的噬菌體整合酶 DNA疫苗　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：丙型病毒性肝炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病和多發(fā)病。丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)感染是造成慢性肝炎,肝硬化及肝癌的主要原因之一。長期以來,由于缺少有效的小動(dòng)物模型,嚴(yán)重阻礙了HCV防治工作的進(jìn)展,迄今尚無有效的治療手段及預(yù)防性疫苗。因此建立具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的小動(dòng)物模型,仍然是當(dāng)今丙型肝炎防治研究的重大課題。 本研究室在前期工作中,基于成年小鼠,聯(lián)合應(yīng)用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)與噬菌體整合酶,初步建立了報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase,Fluc)標(biāo)記的HCV全基因組小鼠體內(nèi)表達(dá)模型,但小鼠體內(nèi)HCV的表達(dá)水平、表達(dá)時(shí)間有待于進(jìn)一步提高,模型的重復(fù)性、穩(wěn)定性尚未評(píng)價(jià)。針對(duì)這一問題,本課題引進(jìn)密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶,對(duì)目的基因在小鼠肝臟長期高效穩(wěn)定表達(dá)的技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行了優(yōu)化,提高了外源基因在小鼠肝細(xì)胞中的整合效率。通過優(yōu)化的技術(shù)平臺(tái),實(shí)現(xiàn)Fluc標(biāo)記的HCV全基因組表達(dá)載體在成年小鼠肝臟染色體上的高效整合,延長了HCV在小鼠體內(nèi)的表達(dá)時(shí)間、提高了表達(dá)量,并對(duì)模型的重復(fù)性、穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià),建立了HCV功能基因表達(dá)小鼠模型。該模型以Fluc作為HCV全基因組表達(dá)的內(nèi)參,HCV功能基因的表達(dá)水平通過活體熒光成像對(duì)Fluc進(jìn)行監(jiān)測(cè)而得以反應(yīng)。迄今為止,HCV全基因組已經(jīng)在小鼠體內(nèi)長期表達(dá)6個(gè)月以上。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建HCV NS3/4A DNA疫苗,以此模型為基礎(chǔ)進(jìn)行HCV NS3/4A DNA疫苗的評(píng)價(jià),為疫苗開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下: 1.目的基因在小鼠肝臟長期高效穩(wěn)定表達(dá)的技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)化 通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法將帶有噬菌體整合酶識(shí)別位點(diǎn)attB的Fluc表達(dá)載體pCI-attB-AATP -Fluc(pAA-Fluc)分別和噬菌體φC31整合酶表達(dá)載體(pCMV-int)以及密碼子優(yōu)化的噬菌體φC31整合酶表達(dá)載體(Pphic31φ)共轉(zhuǎn)染至Balb/c小鼠體內(nèi),活體熒光成像技術(shù)連續(xù)監(jiān)測(cè)Fluc的表達(dá)并對(duì)兩組Fluc活性進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染Pphic31φ組小鼠Fluc活性明顯提高,表達(dá)時(shí)間更長,實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因在小鼠肝臟長期高效穩(wěn)定表達(dá)的技術(shù)平臺(tái)的優(yōu)化。 2.Fluc標(biāo)記的HCV全基因組小鼠體內(nèi)長期表達(dá)模型的優(yōu)化 以上述技術(shù)平臺(tái)為基礎(chǔ),通過水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法將Fluc標(biāo)記的HCV全基因組表達(dá)載體pCI-attB-AATP-Fluc-EMCV IRES-HCV(pAA-Fluc-IRES-HCV)及對(duì)照載體pAA-Fluc分別與Pphic31φ共轉(zhuǎn)染至Balb/c小鼠體內(nèi)。實(shí)驗(yàn)證實(shí),在Pphic31φ作用下,HCV全基因組表達(dá)框架整合到小鼠肝臟第2號(hào)染色體的mpsL1位點(diǎn),在小鼠肝臟獲得穩(wěn)定表達(dá),長達(dá)180d。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí),模型的穩(wěn)定性好,重復(fù)性強(qiáng)。 3.Fluc標(biāo)記的HCV全基因組小鼠體內(nèi)長期表達(dá)模型在疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用 為了驗(yàn)證模型在疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用,我們構(gòu)建了HCV NS3/4A DNA疫苗,以此模型為基礎(chǔ)進(jìn)行HCV NS3/4A DNA疫苗體內(nèi)作用效果的評(píng)價(jià)。為此比較了下肢靜脈水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)、電轉(zhuǎn)染法兩種免疫方式的轉(zhuǎn)染效率,將pGL3-CMV分別通過下肢靜脈水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)、電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染肌肉組織,在不同時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)Fluc活性,發(fā)現(xiàn)下肢靜脈水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染的肌肉組織Fluc的表達(dá)量更高,表達(dá)時(shí)間更長。因此本實(shí)驗(yàn)選擇下肢靜脈水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)作為免疫方式,以NS3/4A表達(dá)載體pVAX-NS3/4A為DNA疫苗免疫Balb/c小鼠,以pVAX作為對(duì)照,免疫兩次后,水動(dòng)力轉(zhuǎn)染pAA-Fluc-IRES-HCV和Pphic31φ質(zhì)粒,觀察Fluc活性的變化。NS3/4A DNA疫苗免疫組,在建模后第5d開始監(jiān)測(cè)到Fluc的下降,第9d出現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果初步表明NS3/4A疫苗促進(jìn)了小鼠免疫系統(tǒng)對(duì)表達(dá)HCV的肝細(xì)胞的清除,推測(cè)可能是NS3/4A疫苗所激發(fā)的CTL反應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞的殺傷造成的,提示本模型可以用于疫苗評(píng)價(jià)。 綜上所述,運(yùn)用密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶,優(yōu)化了目的基因在小鼠肝臟長期高效穩(wěn)定表達(dá)的技術(shù)平臺(tái),提高了Fluc標(biāo)記的HCV全基因組在小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平,并對(duì)模型的重復(fù)性、穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià),建立了HCV全基因組長期表達(dá)小鼠模型。利用該模型對(duì)HCV疫苗進(jìn)行初步評(píng)價(jià),通過報(bào)告基因Fluc活性的高低反映HCV疫苗是否發(fā)生保護(hù)性作用,為HCV疫苗研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 丁f,吳曉暉;“睡美人”轉(zhuǎn)座系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2003年01期

2 靳濤;伍莎;張薪;許莉佳;Oscar Ortegon;葉勤;李云;;Tol1轉(zhuǎn)座子研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2012年05期

3 王怡;詹林盛;;活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];生物技術(shù)通訊;2007年06期

4 孫志東;詹林盛;;高效位點(diǎn)特異性鏈霉菌φC31噬菌體整合酶的研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2007年06期

5 陶然;常玉梅;李世國;唐然;梁利群;李明云;;Tol2轉(zhuǎn)座子的特性及其在轉(zhuǎn)基因魚類中的應(yīng)用[J];水產(chǎn)學(xué)雜志;2014年01期

6 唐文雅;王興龍;張渭東;杜恩岐;陳勝利;王丹陽;黨如意;張淑霞;楊增岐;;穩(wěn)定表達(dá)新城疫病毒V蛋白禽源細(xì)胞系的建立[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2012年11期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 徐煥宇;構(gòu)建表達(dá)φC31整合酶的工具鼠[D];上海交通大學(xué);2008年

2 曹永寬;人AWP1與整合素αV胞內(nèi)功能域的相互作用及其生物學(xué)功能的初步鑒定[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2004年

3 孫志東;HCV IRES小鼠體內(nèi)長期表達(dá)模型的建立及其在藥物評(píng)價(jià)中的應(yīng)用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

4 丁f;piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

5 蘇鳳宜;假單胞菌的快速檢測(cè)及其與表面活性劑的作用機(jī)理研究[D];清華大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 杜雪地;金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子的研究及其轉(zhuǎn)基因應(yīng)用[D];上海海洋大學(xué);2011年

2 辛清婷;鏈霉菌噬菌體ΦC31位點(diǎn)特異性整合酶的結(jié)構(gòu)與功能初步探討[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

3 孫彬;斑馬魚生長抑素轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建及啟動(dòng)子活性分析[D];西南大學(xué);2011年

4 張長青;一元PiggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)及CRISPR-CAS9系統(tǒng)在斑馬魚中的初步應(yīng)用[D];山東大學(xué);2013年

5 宋洋;SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)介導(dǎo)的hLF基因乳腺表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 張曉瑜;利用VBIM系統(tǒng)篩選與EV71感染相關(guān)的宿主細(xì)胞因子[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

，

本文編號(hào)：1470273