本文關(guān)鍵詞： 基質(zhì)金屬蛋白酶-9 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1 左室重構(gòu) 細(xì)胞外基質(zhì) 大鼠　出處：《廣東藥學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 心室重構(gòu)(ventricular remodeling)是多種心血管疾病(如：高血壓病、心肌梗死、心肌病、風(fēng)濕性心臟病等)發(fā)展為慢性心功能不全的主要病理機(jī)制之一。探討心室重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)于防治心功能不全，改善心血管病患者預(yù)后具有重要的意義。 心室重構(gòu)包括心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellar matrix, ECM)量和質(zhì)的變化，并最終導(dǎo)致心室形態(tài)和功能的異常�；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的最主要蛋白水解系統(tǒng)之一，MMPs通過直接溶解心肌中的ECM（如膠原、彈力纖維等），參與多種生理和病理過程�；|(zhì)金屬蛋白酶-9（Matrix metalloproteinases-9,MMP-9）是心肌中主要的MMPs，既往研究已顯示，一些心血管疾病心室重構(gòu)過程中存在MMP-9表達(dá)增高，同時(shí)伴有心肌ECM膠原降解增加、室壁抵抗力下降、心室擴(kuò)大、心功能異常等表現(xiàn)。金屬蛋白酶組織抑制因子-1（Tissue InhibitorMetalloproteinase-1,TIMP-1）作為MMP-9的內(nèi)源性特異抑制因子，可與活性MMP-9以1:1比例共價(jià)結(jié)合形成不可逆復(fù)合物，阻斷MMP-9與底物結(jié)合，從而減少基質(zhì)的降解。以往的研究也顯示一些治療在改善高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)的同時(shí)MMP-9/TIMP-1失衡也獲得明顯改善，提示MMP-9、TIMP-1平衡可能決定著心室重構(gòu)走向。然而，這些結(jié)果大多數(shù)并非來自于直接針對(duì)MMP-9、TIMP-1平衡干預(yù)的研究，而是來自于疾病本身或針對(duì)疾病治療的研究。有必要通過單純MMP-9、TIMP-1失衡模型和直接調(diào)節(jié)兩者失衡的實(shí)驗(yàn)闡明MMP-9、TIMP-1以及MMP-9/TIMP-1對(duì)心室重構(gòu)的影響及其機(jī)制。為此，本研究擬模擬一些疾病的高M(jìn)MP-9狀態(tài)，通過輸入重組大鼠MMP-9提高體內(nèi)MMP-9水平制作高M(jìn)MP-9大鼠模型觀察其心室重構(gòu)的表現(xiàn)，并通過輸入重組大鼠TIMP-1拮抗高M(jìn)MP-9，觀察對(duì)其心室重構(gòu)的影響和機(jī)制。探討高M(jìn)MP-9心室重構(gòu)的治療方法和MMP-9/TIMP-1平衡對(duì)心室重構(gòu)的影響。為進(jìn)一步闡明心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)為心室重構(gòu)尋求新的治療途徑。 目的 探討TIMP-1對(duì)高M(jìn)MP-9表達(dá)引起的心室重構(gòu)是否具有改善作用及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步闡明心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，同時(shí)為心室重構(gòu)尋求新的治療途徑。 方法 1.健康8周齡雄、雌性Wistar大鼠各18只，體重160g～240g，按體重、性別分層隨機(jī)化分為三組：正常對(duì)照組（簡稱對(duì)照組）、高M(jìn)MP-9模型組（簡稱模型組）及TIMP-1干預(yù)組（簡稱干預(yù)組），每組各12只，共36只。各組大鼠的基線水平無明顯差異。以上三組分別給予生理鹽水(2ml)、rrMMP-9=(30ng)(2ml)、rrMMP-9（30ng）+rrTIMP-1（120ng)(2ml)腹腔注射每天1次，每組中的6只連續(xù)注射至第14天，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，此為第一階段組（n=18）；各組剩余的6只大鼠予繼續(xù)注射至第28天，結(jié)束實(shí)驗(yàn)，此為第二階段組（n=18）。 2.兩階段組的實(shí)驗(yàn)前1天、實(shí)驗(yàn)第14天以及第二階段組的第28天予無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓計(jì)測(cè)量血壓。第一和第二階段組分別在實(shí)驗(yàn)第15天和第29天予心臟彩超檢查左室大體結(jié)構(gòu)[左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、舒張末期室間隔厚度（IVSd）、舒張末期左室后壁厚度（LVPWd）、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積（LVESV）]；左室功能[短軸縮短率(LVFS)、心排血量(CO)、每搏輸出量(SV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、二尖瓣血流E峰與A峰的比值(E/A)、心率(HR)]。 3. B超檢查后處死動(dòng)物，ELISA法檢測(cè)血清MMP-9、TIMP-1水平；分離左室以檢測(cè)左室重量指數(shù)（LVWI=左室重量mg/體重g）；HE染色（蘇木素-伊紅染色）觀察光鏡下心肌細(xì)胞及心肌間質(zhì)的變化；VG（van Gieson）染色觀察心肌間質(zhì)膠原分布，圖像分析法測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）；免疫印跡法（western blotting）檢測(cè)心肌組織中MMP-9、TIMP-1水平以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原水平；RT-PCR法檢測(cè)心肌組織中MMP-9mRNA和TIMP-1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 1.模型組左室重量指數(shù)的變化及TIMP-1干預(yù)的影響 第一階段模型組左室重量指數(shù)顯著性高于對(duì)照組(P0.05)，TIMP-1干預(yù)后呈進(jìn)一步增高趨勢(shì)。第二階段左室重量指數(shù)變化與第一階段相似。 2.模型組左室大體結(jié)構(gòu)和功能的改變及TIMP-1干預(yù)的影響 1）第一階段模型組LVIDd和LVEDV相比對(duì)照組呈增大趨勢(shì)，TIMP-1干預(yù)后有所減輕，但差異未達(dá)顯著性(P0.05). 2）第二階段模型組LVIDd和LVEDV顯著大于對(duì)照組(P0.05)，TIMP-1干預(yù)組該指標(biāo)與對(duì)照組比無明顯差異(P0.05)，提示TIMP-1干預(yù)后左室增大情況有所改善。 3）其余結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)與對(duì)照組比均未見明顯差異。 3.模型組心肌組織病理形態(tài)學(xué)的改變及TIMP-1干預(yù)的影響 1）形態(tài)學(xué)改變(HE染色)：第一階段模型組心肌細(xì)胞較對(duì)照組排列紊亂，心肌纖維斷裂，胞漿溶解壞死，小血管壁增厚。TIMP-1干預(yù)后心肌細(xì)胞排列較模型組整齊，心肌纖維斷裂、胞漿溶解壞死明顯改善。第二階段上述改變更為明顯。 2）心肌間質(zhì)膠原變化(VG染色)：第一階段模型組與對(duì)照組相比，心肌間質(zhì)膠原含量減少，TIMP-1干預(yù)后，膠原含量增多。CVF值：第一階段模型組CVF值顯著性低于對(duì)照組(P0.05)，TIMP-1干預(yù)后，CVF值明顯增高，而且高于對(duì)照組(P0.05)。第二階段各組大鼠心肌間質(zhì)膠原含量、分布以及CVF變化情況與第一階段相似。 4.模型組心肌組織中MMP-9、TIMP-1水平的改變及TIMP-1干預(yù)的影響 1）第一階段模型組心肌組織中MMP-9水平顯著高于對(duì)照組(P0.001)，TIMP-1水平顯著低于對(duì)照組(P0.001)。TIMP-1干預(yù)后，MMP-9水平降低為顯著低于對(duì)照組(P0.001)，TIMP-1水平則升高至顯著高于對(duì)照組(P0.001)。第二階段各組大鼠心肌組織MMP-9、TIMP-1水平的改變與第一階段類似。 2）第一階段模型組MMP-9/TIMP-1比值顯著高于對(duì)照組(P0.001)，TIMP-1干預(yù)后MMP-9/TIMP-1比值明顯下降，顯著低于對(duì)照組(P0.001)。第二階段對(duì)照組MMP-9/TIMP-1比值與第一階段相當(dāng)，模型組MMP-9/TIMP-1比值高于第一階段，TIMP-1干預(yù)后MMP-9/TIMP-1比值與第一階段相近似，提示隨著時(shí)間的延長，TIMP-1干預(yù)的矯治作用更明顯。 5.心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與LVWI、LVIDd、CVF的相關(guān)性分析 1）LVWI： ①第一階段心肌組織MMP-9水平與LVWI無明顯相關(guān)性(r=0.377，P0.05)；TIMP-1水平與LVWI呈正相關(guān)(r=0.528,P0.05)；MMP-9/TIMP-1比值與LVWI無明顯相關(guān)性(r=0.396,P0.05)。 ②第二階段心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與LVWI的相關(guān)性與第一階段相似。即,心肌組織MMP-9水平與LVWI無明顯相關(guān)性(r=0.270，P0.05)；TIMP-1水平與LVWI呈正相關(guān)(r=0.499,P0.05)；MMP-9/TIMP-1比值與LVWI無明顯相關(guān)性(r=0.078,P0.05)。 2）LVIDd： ①第一階段心肌組織MMP-9水平與LVIDd呈正相關(guān)(r=0.550，P0.05)；TIMP-1水平與LVIDd呈負(fù)相關(guān)(r=-0.496,P0.05)；MMP-9/TIMP-1比值與LVIDd呈正相關(guān)(r=0.549,P0.05)。 ②第二階段心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與LVIDd的相關(guān)性與第一階段相似。即，心肌組織MMP-9水平與LVIDd呈正相關(guān)(r=0.515，P0.05)；TIMP-1水平與LVIDd呈負(fù)相關(guān)(r=-0.471,P0.05)；MMP-9/TIMP-1比值與LVIDd呈正相關(guān)(r=0.614,P0.01)。 3）CVF： ①第一階段心肌組織MMP-9水平與CVF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.632，P0.001)；TIMP-1水平與CVF呈正相關(guān)(r=0.610，P0.001)。MMP-9/TIMP-1比值與CVF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.612，P0.001)。 ②第二階段心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與CVF的相關(guān)性與第一階段相似，但相關(guān)程度提高。即，心肌組織MMP-9水平與CVF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.815，P0.001)；TIMP-1水平與CVF呈正相關(guān)(r=0.779，P0.001)；MMP-9/TIMP-1比值與CVF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.792,P0.001)。6.模型組血清MMP-9、TIMP-1水平的改變及TIMP-1干預(yù)的影響 1）第一階段模型組血清MMP-9水平顯著高于對(duì)照組(P0.001)，TIMP-1干預(yù)后血清MMP-9水平有所減低，但仍高于對(duì)照組(P0.001)；模型組血清TIMP-1水平顯著高于對(duì)照組(P0.001)，TIMP-1干預(yù)后血清TIMP-1水平進(jìn)一步增高。 2）第二階段各組血清MMP-9、TIMP-1水平改變和第一階段類似。 7.心肌組織MMP-9、TIMP-1水平與血清MMP-9、TIMP-1水平的相關(guān)性 1）第一階段心肌組織MMP-9水平與血清MMP-9水平無明顯相關(guān)性(r=0.326,P0.05)；心肌組織TIMP-1水平與血清TIMP-1水平無明顯相關(guān)性(r=0.415, P0.05)；心肌組織MMP-9/TIMP-1比值與血清MMP-9/TIMP-1比值呈正相關(guān)(r=0.838，P0.001)。 2）第二階段心肌組織和血清MMP-9、TIMP-1的相關(guān)性與第一階段相似。即，心肌組織MMP-9水平與血清MMP-9水平無明顯相關(guān)性(r=0.439,P0.05)；心肌組織TIMP-1水平與血清TIMP-1水平無明顯相關(guān)性(r=0.212,P0.05)；心肌組織MMP-9/TIMP-1比值與血清MMP-9/TIMP-1比值呈正相關(guān)(r=0.929，P0.001)。 8.模型組心肌組織中Ⅰ型、Ⅲ型膠原水平的改變及TIMP-1干預(yù)的影響 1）第一階段模型組心肌組織中Ⅰ型膠原水平顯著低于對(duì)照組(P0.001)；TIMP-1干預(yù)后Ⅰ型膠原水平有所提高，但仍顯著低于對(duì)照組(P0.001)；第二階段模型組Ⅰ型膠原水平降低更明顯，TIMP-1干預(yù)后Ⅰ型膠原水平與第一階段相近。 2）第一階段模型組心肌組織中Ⅲ型膠原水平顯著低于對(duì)照組(P0.05)；TIMP-1干預(yù)后Ⅲ型膠原水平顯著提高并且高于對(duì)照組(P0.01，，P0.05)。第二階段Ⅲ型膠原水平變化情況與第一階段類似。但由于對(duì)照組心肌組織中Ⅲ型膠原水平較第一階段明顯升高，因此，TIMP-1干預(yù)組Ⅲ型膠原水平反而比第一階段更接近對(duì)照組。 3）第一階段模型組Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值顯著低于對(duì)照組(P0.001)，TIMP-1干預(yù)后進(jìn)一步降低(P0.05)。第二階段模型組Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值仍顯著低于對(duì)照組(P0.001)，但TIMP-1干預(yù)后卻高于模型組(P0.05)，且由于對(duì)照組Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值較第一階段降低，TIMP-1干預(yù)組該比值雖仍低于對(duì)照組(P0.001)，但比第一階段更接近于對(duì)照組。 9.心肌組織MMP-9mRNA和TIMP-1mRNA的表達(dá) 1）第一階段各組大鼠心肌組織未見MMP-9mRNA表達(dá)，但部分有TIMP-1mRNA表達(dá)。 2）第二階段各組大鼠心肌組織也未見MMP-9mRNA表達(dá)，但TIMP-1mRNA表達(dá)率較第一階段高。 10.模型組血壓的改變及TIMP-1干預(yù)的影響 1）第一階段模型組大鼠收縮壓及舒張壓水平均顯著高于對(duì)照組(P0.01),TIMP-1干預(yù)后血壓無明顯變化(P0.05)。 2）第二階段模型組大鼠2周時(shí)收縮壓及舒張壓水平均顯著高于對(duì)照組(P0.01),4周時(shí)更高，TIMP-1干預(yù)后2周時(shí)血壓無明顯改變(P0.05)，4周時(shí)收縮壓升高有所變緩，舒張壓則有所回降，但仍顯著高于對(duì)照組，且與模型組相比差異尚不明顯。 結(jié)論 1.輸入MMP-9可以引起大鼠心室重構(gòu)，TIMP-1干預(yù)可改善該重構(gòu)過程。重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展和干預(yù)治療的作用與心肌組織MMP-9、TIMP-1水平，MMP-9/TIMP-1平衡有顯著關(guān)系。 2.心肌組織內(nèi)高M(jìn)MP-9表達(dá)可顯著降解膠原，導(dǎo)致膠原容積分?jǐn)?shù)降低、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原水平降低、Ⅰ/Ⅲ膠原比例下降，促使左室腔不斷擴(kuò)大。TIMP-1通過抑制膠原降解,促使膠原容積分?jǐn)?shù)及Ⅰ型、Ⅲ型膠原水平增高，恢復(fù)Ⅰ/Ⅲ膠原比例，從而減緩左室腔擴(kuò)大，改善高M(jìn)MP-9表達(dá)引起的左室重構(gòu)。 3.血清MMP-9、TIMP-1水平與心肌組織MMP-9、TIMP-1水平無明顯相關(guān)性，但血清與心肌組織MMP-9/TIMP-1比值相關(guān)性良好。 4.高M(jìn)MP-9水平可引起大鼠血壓升高，但TIMP-1對(duì)高M(jìn)MP-9引起的心室重構(gòu)的改善作用與血壓無關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R-332;R541

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1468178