發(fā)布時(shí)間：2018-01-26 07:15

  本文關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)基因小鼠 血栓調(diào)節(jié)蛋白 活化蛋白C 組織特異性表達(dá) Tie2-Cre小鼠　出處：《華中科技大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 1.構(gòu)建血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)表達(dá)質(zhì)粒并分析其在細(xì)胞中的生物學(xué)活性; 2.建立組織特異性過表達(dá)TM的小鼠模型并分析其在動物體內(nèi)的生物學(xué)活性。 方法 1. RT-PCR獲取野生型小鼠肺組織中TM基因片段; 2. TOPO表達(dá)載體連接TM基因片段,相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SVEC細(xì)胞后,檢測細(xì)胞增殖和凋亡,以及蛋白C活化試驗(yàn); 3. PCCALL2表達(dá)載體連接TM基因片段,相應(yīng)質(zhì)粒PTMHL與Cre質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SVEC細(xì)胞后,檢測TM的表達(dá),以及蛋白C活化試驗(yàn); 4.顯微注射法將構(gòu)建成功的PTMHL質(zhì)粒注入供體C57BL/6小鼠受精卵細(xì)胞后,采用轉(zhuǎn)基因小鼠的個(gè)體組織(鼠尾)中提取基因組DNA進(jìn)行PCR分析,鑒定基因型; 5.新生PTMHL轉(zhuǎn)基因小鼠與Tie2-Cre小鼠雜交,采用轉(zhuǎn)基因小鼠的個(gè)體組織(鼠尾)中提取基因組DNA進(jìn)行PCR分析,對其TM基因型和Cre基因型鑒定,Western blot和免疫組化法檢測組織中TM抗體的表達(dá),用蛋白C活性分析法檢測TM轉(zhuǎn)基因小鼠對蛋白C活化的影響。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建真核表達(dá)TM的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染SVEC細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖和凋亡得到抑制,細(xì)胞中的TM生物活性增強(qiáng); 2.成功構(gòu)建組織特異性表達(dá)TM的質(zhì)粒PTMHL,用此質(zhì)粒和表達(dá)Cre質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SVEC細(xì)胞后只有在表達(dá)Cre的情況下TM才會過表達(dá),此外細(xì)胞中的TM生物活性增強(qiáng); 3.成功構(gòu)建組織特異性過表達(dá)TM的小鼠模型,同Tie2-Cre小鼠雜交后,新生小鼠的心臟,腎臟,肝臟,肺等組織中內(nèi)皮細(xì)胞的TM表達(dá)明顯增強(qiáng),轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)TM的生物活性增加。
[Abstract]:Purpose 1. The expression plasmid of thrombomodulin (TMN) was constructed and its biological activity in cells was analyzed. 2. To establish a mouse model of tissue specific overexpression of TM and to analyze its biological activity in vivo. Method 1. The TM gene fragment in the lung tissue of wild-type mice was obtained by RT-PCR. 2. The TM gene fragment was ligated into the TOPO expression vector. After transfection of the corresponding plasmid into SVEC cells, cell proliferation and apoptosis, as well as protein C activation test were detected. 3. The TM gene fragment was ligated into the PCCALL2 expression vector. After the corresponding plasmid PTMHL and Cre plasmid were co-transfected into SVEC cells, the expression of TM and protein C activation test were detected. 4. The constructed PTMHL plasmid was injected into donor C57BL / 6 mouse fertilized egg cells by microinjection. Genomic DNA was extracted from the individual tissues of transgenic mice (mouse tail) for PCR analysis and genotypes were identified. 5. PTMHL transgenic mice were hybridized with Tie2-Cre mice. Genomic DNA was extracted from the individual tissues of transgenic mice (mouse tail) for PCR analysis. The expression of TM antibody was detected by Western blot and immunohistochemistry. The effect of TM transgenic mice on the activation of protein C was detected by protein C activity analysis. Results 1. The eukaryotic plasmids expressing TM were successfully constructed. After transfection into SVEC cells, the proliferation and apoptosis of the cells were inhibited, and the biological activity of TM in the cells was enhanced. 2. The tissue specific expression plasmid PTMHL1 was successfully constructed, which was co-transfected into SVEC cells by using this plasmid and the expressed Cre plasmid. Only in the case of Cre expression could TM be overexpressed. In addition, the biological activity of TM in cells was enhanced. 3.The mouse model of tissue specific overexpression of TM was successfully constructed. After hybridization with Tie2-Cre mice, the heart, kidney and liver of newborn mice were obtained. The expression of TM in endothelial cells was significantly increased in lung tissues, and the biological activity of TM in transgenic mice was increased.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R-332

【共引文獻(xiàn)】

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7 彭s，

本文編號：1465033