發(fā)布時(shí)間：2018-01-24 17:19

  本文關(guān)鍵詞： 載脂蛋白E 施萬細(xì)胞 白介素-6 白介素-10 一氧化氮 核因子κB　出處：《吉林大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近十余年的研究證明,載脂蛋白E(ApoE)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。SCs作為周圍神經(jīng)髓鞘形成細(xì)胞在周圍神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用,同時(shí)SCs也是被自身免疫反應(yīng)攻擊的目標(biāo)。許多文獻(xiàn)闡述了ApoE不同亞型在周圍神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病中發(fā)揮的差異性作用。目前尚未有人研究不同基因型ApoE對(duì)于SCs在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中免疫調(diào)節(jié)功能有何具體影響。 在本次研究中,作者分別從人類ApoE2,ApoE3和ApoE4的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)提取并培養(yǎng)SCs,以促炎因子脂多糖(LPS)聯(lián)合干擾素(IFN)-γ施加刺激,然后應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)、ELISA等技術(shù)比較不同系別小鼠的SCs在體外表達(dá)細(xì)胞因子,產(chǎn)生一氧化氮的情況,以探討表達(dá)不同人類ApoE基因亞型的SCs在應(yīng)對(duì)炎性刺激時(shí)的免疫應(yīng)答。此外,作者還應(yīng)用Western blot技術(shù)針對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路做了進(jìn)一步的研究,試圖發(fā)現(xiàn)有哪些具體的分子參與到該免疫應(yīng)答中。 本研究發(fā)現(xiàn)炎性刺激后施萬細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變—體積變大,細(xì)胞突觸減少,邊緣變模糊。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示本次實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的施萬細(xì)胞為同系細(xì)胞群。超過95%的施萬細(xì)胞表達(dá)載脂蛋白E。另外,流式細(xì)胞儀針對(duì)抗-S100抗體的檢測(cè)結(jié)果顯示本次實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)的施萬細(xì)胞純度超過96%。 ApoE3促進(jìn)施萬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-10和NO。為深入研究不同亞型ApoE在應(yīng)對(duì)炎性應(yīng)答中的作用,我們對(duì)三種轉(zhuǎn)基因鼠(ApoE2,ApoE3和ApoE4)的施萬細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子水平(TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10)以及培養(yǎng)液上清中的細(xì)胞因子水平(僅IL-6,IL-10和NO)進(jìn)行了檢測(cè)。刺激前,流式細(xì)胞儀幾乎無法探測(cè)到SCs胞內(nèi)TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6以及IL-10的表達(dá)量。然而經(jīng)LPS和IFN-γ刺激72小時(shí)后,上述5種細(xì)胞因子在各組小鼠的SCs內(nèi)表達(dá)量明顯提高。ApoE3轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)組的施萬細(xì)胞胞內(nèi)IL-6和IL-10的表達(dá)水平明顯高于ApoE2和ApoE4組。各實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞外培養(yǎng)液上清中的IL-6,IL-10和NO相對(duì)濃度也隨炎性刺激的加入而明顯提高。ApoE4轉(zhuǎn)基因小鼠SCs培養(yǎng)基上清中IL-6,IL-10和NO的產(chǎn)生量明顯低于ApoE3組。另外炎性刺激前,流式細(xì)胞學(xué)方法未檢測(cè)到SCs表達(dá)iNOS。而炎性刺激后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)出iNOS陽性的SCs比例超過99%。無論從陽性細(xì)胞率方面比較,還是從幾何平均熒光強(qiáng)度比較,iNOS的表達(dá)量在各組間無顯著性差異。 ApoE亞型對(duì)共刺激分子和ApoE的表達(dá)無影響。在免疫炎性應(yīng)答中,共刺激分子—如CD80、CD86、MHC-II,CD1d和TLR-4等—能否在施萬細(xì)胞內(nèi)或表面表達(dá)對(duì)免疫應(yīng)答影響很大。炎性刺激前,這些分子幾乎難以測(cè)得到,而在炎性刺激后,CD80、CD86、MHC-II,CD1d和TLR-4的表達(dá)量都有所上升。不過這些分子的表達(dá)水平?jīng)]有組間顯著性差異。不論是依靠流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度測(cè)得的SCs內(nèi)表達(dá)的ApoE含量,還是依靠酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)得的培養(yǎng)液上清中的ApoE濃度,都未發(fā)現(xiàn)組間存在顯著性差異。 ApoE3抑制信號(hào)傳導(dǎo)通路中的NFκB和Akt的表達(dá)。我們選擇了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路中的兩個(gè)重要分子—NFκB和Akt作為研究對(duì)象,應(yīng)用Western blot技術(shù),試圖通過對(duì)這兩種分子在SCs內(nèi)表達(dá)量的不同,探討不同亞型的ApoE是如何發(fā)揮各自的作用的。結(jié)果顯示,在炎性刺激后,ApoE3的NFκB表達(dá)量最低,其次是ApoE4和ApoE2。另外,ApoE3和ApoE4組在刺激后表達(dá)Akt分子的水平低于ApoE2組。 結(jié)論:(1)在體外實(shí)驗(yàn)中,施萬細(xì)胞是以一種ApoE亞型依賴的模式應(yīng)對(duì)炎癥刺激的。(2)在調(diào)控局部炎癥應(yīng)答過程中,ApoE3轉(zhuǎn)基因小鼠的SCs比ApoE2和ApoE4轉(zhuǎn)基因小鼠的SCs能夠產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子和NO,因而其免疫調(diào)控能力也更強(qiáng)。(3)本研究也許有利于從ApoE基因型的角度解釋周圍神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性疾病。
[Abstract]:Nearly ten years of research shows that apolipoprotein E (ApoE) is an important immunoregulatory function of.SCs as a peripheral nerve myelin forming cells play an important role in the peripheral nervous system autoimmune disease in the central nervous system autoimmune disease, while SCs is the autoimmune response target. Many described in the literature different effects of different subtypes of ApoE play in the peripheral nervous system disease immunity. Yet there are people of different genotype ApoE has specific effect on SCs in the peripheral nervous system regulate immune function.
In this study, the author respectively from human ApoE2 transgenic mice, ApoE3 and ApoE4 were extracted and cultured SCs, the pro-inflammatory cytokine lipopolysaccharide (LPS) combined with interferon (IFN) gamma stimulus, flow cytometry and ELISA technology application, compare the expression of cytokines in other mouse SCs in vitro, produce no, the immune response is to investigate the expression of human ApoE gene in different subtypes of SCs in response to inflammatory stimuli. In addition, the author also used Western blot technology for cell signal transduction pathways to do further research, trying to find what specific molecules involved in the immune response.
The study found that inflammatory stimulation of Schwann cell morphological changes, cell volume change, synaptic reduction, edge blur. Flow cytometry results showed that cultured Schwann cells in this experiment for homologous cell populations. More than 95% of the Schwann cell expression of apolipoprotein E. in addition, flow cytometry needle the detection of anti -S100 antibody showed the purity of Schwann cells cultured in this experiment, more than 96%.
ApoE3 promotes the IL-6 production of Schwann cells, IL-10 and NO. for further study on effect of different subtypes of ApoE in response to inflammatory response, we have three kinds of transgenic mice (ApoE2, ApoE3 and ApoE4) levels of cytokines in Schwann cells (TNF- alpha, IFN- gamma, IL-4, IL-6 and IL-10) and cell factor level the supernatant (only IL-6, IL-10 and NO) were detected. Before stimulation, almost impossible to detect intracellular SCs TNF- alpha, flow cytometry, IFN- gamma, IL-4, IL-6 and IL-10 expression. However, by LPS and IFN- gamma 72 hours after stimulation, the expression of the 5 cytokines in each group the amount of SCs in mice significantly increased the expression level of the experimental group of.ApoE3 transgenic mouse Schwann cells and intracellular IL-6 and IL-10 were significantly higher than that of ApoE2 and ApoE4 group. In the culture supernatant of IL-6 cells in each experimental group, IL-10 and NO relative concentration with the inflammatory stimulus to join and improve.ApoE4 transgenic Because the mouse SCs IL-6 culture medium supernatant produced IL-10 and NO were significantly lower than that of ApoE3 group. In addition to inflammatory stimulation, flow cytometry method did not detect the SCs expression of iNOS. and inflammatory stimulation, flow cytometry to detect iNOS positive SCs ratio of more than 99%. in terms of the percentage of positive cells. Compared. Or from the geometric mean fluorescence intensity in comparison, no significant difference in the expression of iNOS in all groups.
No effect on the expression of ApoE subtypes of costimulatory molecules and ApoE. The immune inflammatory response, costimulatory molecules, such as CD80, CD86, MHC-II, CD1d and TLR-4 - whether in Schwann cells or surface expression has great influence on the immune response to inflammatory stimuli. Before these molecules hardly can be measured, and in inflammatory stimulation, CD80, CD86, MHC-II, CD1d and TLR-4 expression were increased. But the expression levels of these molecules have no significant differences. Whether the expression is depend on the mean fluorescence intensity of flow cytometry was used to detect the measured SCs content of ApoE, or rely on ELISA (ELISA) ApoE concentration in the culture supernatant were measured and found no significant differences between the groups.
The inhibition of expression of ApoE3 signaling pathway in NF kappa B and Akt. We chose two important molecules and intracellular signal transduction pathways in NF kappa B and Akt as the research object, the application of Western blot technology, through to these two molecules different expression levels in the SCs, to explore the different subtypes the ApoE is how to play their respective roles. The results showed that in inflammatory stimulation, ApoE3 NF K B expression was the lowest, followed by ApoE4 and ApoE2. in ApoE3 and ApoE4 expression in group Akt after stimulation molecular level is lower than the ApoE2 group.
Conclusion: (1) in vitro, Schwann cells is a model in response to inflammation by ApoE subtype dependent stimulation. (2) in the process of regulation of local inflammatory responses in ApoE3 transgenic mice than SCs ApoE2 and ApoE4 SCs transgenic mice can produce more cytokines and NO, and its immune regulation have a stronger ability. (3) this study may benefit from the ApoE genotype to explain the inflammatory diseases of the peripheral nervous system.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.12

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本文編號(hào)：1460573