本文關(guān)鍵詞： 抗病毒治療 DNA疫苗 中國(guó)旱獺 土撥鼠肝炎病毒　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 1.研究不同地區(qū)旱獺對(duì)WHV的易感性，了解不同毒株、不同劑量的WHV接種旱獺后的自然經(jīng)過(guò)，完善WHV感染的旱獺模型，。 2.建立旱獺T淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測(cè)方法。 3.研究恩替卡韋聯(lián)合DNA疫苗pWHcIm對(duì)WHV感染的早期干預(yù)作用。 方法 1.捕獲來(lái)自不同地區(qū)的旱獺，靜脈接種含有WHV病毒的血清，觀察其對(duì)WHV的易感性；用不同的WHV毒株接種易感地區(qū)的旱獺，觀察不同毒株的影響；分別用高，中，低劑量的WHV59毒株接種易感地區(qū)的旱獺，觀察不同劑量的WHV接種后的自然經(jīng)過(guò)。 2.分離旱獺PBMC，建立旱獺T細(xì)胞應(yīng)答的檢測(cè)方法，包括CFSE染色檢測(cè)旱獺PBMC增殖，CD107a檢測(cè)旱獺特異性CTL應(yīng)答，PD1，PDL1，F(xiàn)OXP3染色及其免疫應(yīng)答相關(guān)分子mRNA表達(dá)的real-time RT-PCR的方法。 3.野外捕獲的成年旱獺24只，體重在2-3kg。經(jīng)足背靜脈接種含有WHV59病毒的血清，病毒接種后24小時(shí)，18只旱獺分別經(jīng)過(guò)如下三種處理：口服抗病毒藥物恩替卡韋，0.5mg/kg/day，持續(xù)服用8周；在接種病毒后的第1,4,7周用表達(dá)WHV核心抗原的質(zhì)粒免疫；口服恩替卡韋聯(lián)合質(zhì)粒免疫。余下6只旱獺作為空白對(duì)照。20周后，旱獺接種WHV0908毒株。選擇2只健康旱獺作為此次病毒接種的對(duì)照。應(yīng)用ELISA、real-time-PCR檢測(cè)旱獺血清WHV感染標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化：WHsAg、WHsAb、WHcAb和WHV DNA。real-time-RT-PCR檢測(cè)旱獺PBMC中免疫應(yīng)答相關(guān)分子的表達(dá)。 結(jié)果 1.來(lái)自1，3地區(qū)的喜馬拉雅旱獺對(duì)WHV易感，病毒呈現(xiàn)高復(fù)制；WHV59毒株使喜馬拉雅旱獺出現(xiàn)急性感染，而WHV59的傳代毒株（stock0908和stock0925）使旱獺同樣出現(xiàn)急性感染；中劑量WHV59接種后旱獺出現(xiàn)病毒血癥的時(shí)間延遲，而低劑量WHV接種旱獺后不能出現(xiàn)病毒血癥。 2.新鮮分離的旱獺PBMC進(jìn)行CFSE染色，5μg/ml的ConA刺激旱獺淋巴細(xì)胞5天，CFSEdim CD4+細(xì)胞百分比高達(dá)92.15%。新鮮分離急性WHV感染旱獺的PBMC，2μg/ml WHc96-110的肽段特異性刺激3天后，CD3+CD4-CD107a的表達(dá)為3.98%，相比2μg/ml CMV無(wú)關(guān)多肽刺激（0.85%）和空白對(duì)照（0.67%）有明顯的增高。在病毒血癥高峰期，CD4-細(xì)胞的PD-1表達(dá)達(dá)到高峰，陽(yáng)性細(xì)胞百分比達(dá)到13.77%，CD4+細(xì)胞的FOXP3的表達(dá)為4.44%，PD-L1在病毒血癥晚期CD4+和CD4-T細(xì)胞均有短暫上調(diào)，其百分比分別為2.17%和6.05%，病毒清除后降至正常水平。 3.24只成年旱獺初次WHV感染后，所有僅用DNA疫苗免疫的旱獺均出現(xiàn)病毒血癥和核心抗體，與未處理的對(duì)照旱獺相似。除僅用恩替卡韋處理的2只旱獺未出現(xiàn)WHcAb外，恩替卡韋聯(lián)合質(zhì)粒免疫及僅用恩替卡韋處理的所有旱獺均出現(xiàn)WHcAb而未出現(xiàn)病毒血癥。再次病毒接種后，所有的質(zhì)粒免疫旱獺，恩替卡韋聯(lián)合質(zhì)粒免疫的旱獺以及未處理的對(duì)照動(dòng)物及其部分僅用恩替卡韋處理的旱獺（4/6）均不出現(xiàn)病毒血癥。 結(jié)論 1.旱獺的遺傳背景及病毒的接種劑量影響WHV感染的結(jié)局，傳代病毒接種產(chǎn)生與原代病毒感染類此的感染結(jié)局。 2.建立了旱獺T細(xì)胞應(yīng)答的檢測(cè)方法，為旱獺WHV感染模型應(yīng)用于HBV感染的免疫發(fā)病機(jī)制研究及評(píng)估免疫治療策略提供研究手段。 3.早期應(yīng)用抗病毒藥物和/或抗病毒藥物聯(lián)合DNA疫苗，，可以抵御WHV的初次感染，且部分或全部旱獺產(chǎn)生了有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，可以抵御WHV的再次感染。 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及意義 1.旱獺廣泛分布在我國(guó)西北特別是青藏高原，與土撥鼠種系（線粒體DNA序列分析）發(fā)生十分接近，近年已經(jīng)報(bào)道中國(guó)旱獺對(duì)WHV有易感性，因此WHV感染旱獺模型非常適合于研究嗜肝病毒的急慢性感染。 2.首次在旱獺WHV感染模型體內(nèi)建立T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的檢測(cè)方法，包括CFSE染色檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖，CD107a及流式細(xì)胞術(shù)分析特異性CTL應(yīng)答，real-timeRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)，為旱獺模型的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供研究手段。 3.首次利用WHV感染旱獺模型研究早期應(yīng)用抗病毒藥物和/或抗病毒藥物聯(lián)合DNA疫苗對(duì)WHV感染過(guò)程的影響，為探討HBV感染后的早期免疫應(yīng)答及保護(hù)性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為HBV意外或針刺暴露者提供新的干預(yù)方案。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R512.62;R392.11

【共引文獻(xiàn)】

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2 Stephan Menne;Paul J Cote;;The woodchuck as an animal model for pathogenesis and therapy of chronic hepatitis B virus infection[J];World Journal of Gastroenterology;2007年01期

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本文編號(hào)：1459410