本文關(guān)鍵詞： 組織因子 脂多糖 真核表達(dá)載體 流式細(xì)胞術(shù) 單核細(xì)胞　出處：《中南大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：動(dòng)脈血栓形成是急性心肌梗塞和腦梗死的主要誘因,也是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的死亡原因。組織因子(TF)是生理性止血和病理性形成血栓的啟動(dòng)因子,它在血栓形成中的起始作用越來(lái)越受到人們的重視。單核細(xì)胞作為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中TF來(lái)源的細(xì)胞-泡沫細(xì)胞的前身,研究其TF的表達(dá)調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)前臨床醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)之一。 國(guó)內(nèi)外大量研究表明,不穩(wěn)定型心絞痛、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、高血壓和高血脂等心腦血管疾病患者血液中單核細(xì)胞的TF都處在高表達(dá)的水平；同時(shí)發(fā)現(xiàn),具有抗血栓作用以及血管內(nèi)皮保護(hù)功能的KLF2基因在急性冠狀動(dòng)脈綜合癥病人的單核細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)。因此,本研究旨在構(gòu)建pEGFP-N3-KLF2高表達(dá)載體,并且觀察LPS對(duì)KLF2高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞表達(dá)TF的影響,為豐富凝血理論提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的：構(gòu)建pEGFP-N3-KLF2高表達(dá)載體,并且觀察LPS對(duì)KLF2高表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞表達(dá)TF的影響。 方法：從NCBI獲得klf2基因序列,運(yùn)用premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物,運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增klf2基因,電泳檢測(cè)正確后,進(jìn)行純化回收,然后將純化回收產(chǎn)物連pEGFP-N3載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化,再挑單克隆以及搖菌,小提質(zhì)粒,最后進(jìn)行雙酶切檢測(cè)和PCR檢測(cè),當(dāng)兩項(xiàng)結(jié)果均正確時(shí),送pEGFP-N3-KLF2新鮮菌液去測(cè)序。將單核細(xì)胞分為5組：①正常細(xì)胞組,②轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組,③轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒組,④LPS組,⑤LPS+轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒組。分別培養(yǎng)2 h、12 h、24 h、48 h和72 h后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組各時(shí)間點(diǎn)TF蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果：陽(yáng)性克隆篩選和測(cè)序結(jié)果顯示,pE-GFP-N3-KLF2高表達(dá)載體構(gòu)建成功。在實(shí)驗(yàn)觀察的2h至72h內(nèi),正常組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)TF表達(dá)基本一致,各觀察點(diǎn)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與正常對(duì)照組相比,空載體組和高表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組TF表達(dá)也無(wú)顯著性差異(P0.05)。LPS組表達(dá)TF從12h起明顯增加,至48h達(dá)到高峰,與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.01),而LPS+高表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組TF表達(dá)量明顯降低,與LPS組同一時(shí)間點(diǎn)的TF表達(dá)量相比,差異具有顯著性意義(P0.01)。 結(jié)論：①利用具有標(biāo)志綠色熒光蛋白的pEGFP-N3質(zhì)粒載體構(gòu)建了KLF2高表達(dá)質(zhì)粒,并經(jīng)測(cè)序鑒定后pEGFP-N3-KLF2高表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。②LPS能顯著地刺激THP-1表達(dá)TF,但這種誘導(dǎo)作用可被轉(zhuǎn)染KLF2高表達(dá)的質(zhì)粒所抑制。
[Abstract]:Arterial thrombosis is the main cause of acute myocardial infarction and cerebral infarction and the most common cause of death in developed countries. Mononuclear cells, the precursor of TF derived cells and foam cells in atherosclerotic plaques, have attracted more and more attention in the initiation of thrombosis. The study of TF expression regulation mechanism has become one of the hotspots in clinical medicine. A large number of studies at home and abroad show that, unstable angina pectoris, acute coronary syndrome, hypertension and hyperlipidemia in patients with cardiovascular and cerebrovascular diseases such as blood monocyte TF is in a high level of expression; It was also found that the expression of KLF2 gene with antithrombotic effect and vascular endothelial protection was significantly down-regulated in monocytes of patients with acute coronary syndrome. The purpose of this study was to construct a high expression vector of pEGFP-N3-KLF2 and to observe the effect of LPS on TF expression in THP-1 cells transfected with high expression vector of KLF2. It provides a new experimental basis for enriching clotting theory. Aim: to construct the high expression vector of pEGFP-N3-KLF2 and to observe the effect of LPS on TF expression in THP-1 cells transfected with high expression vector of KLF2. Methods: klf2 gene sequence was obtained from NCBI, primers were designed by premier5.0 software, and klf2 gene was amplified by PCR technique. Then the purified and recovered product was transformed into pEGFP-N3 vector, then the monoclonal and shaking bacteria were selected, and the plasmid was extracted. Finally, the double enzyme digestion and PCR detection were carried out, when the two results were correct. The mononuclear cells were divided into 5 groups: 1: 1 normal cell group: 1 / 2 transfected empty plasmid group and 3 transfected with high expression plasmid group (LPS-4). 5the high expression plasmid group was transfected with LPS. After cultured for 2 h for 12 h and 24 h for 48 h and 72 h, the changes of TF protein expression at each time point were detected by flow cytometry. Results: the results of positive clone screening and sequencing showed that the high expression vector pE-GFP-N3-KLF2 was successfully constructed and was observed within 2 to 72 hours. The TF expression of normal cells was basically the same at all time points, but there was no statistical difference among the observation points. There was no significant difference in TF expression between the empty vector group and the high expression plasmid group compared with the normal control group. The expression of TF in the P0.05 + LPS group was significantly increased from 12 h to the peak at 48 h. Compared with the control group, the difference was statistically significant (p0.01), while the TF expression in the high expression plasmid group of LPS was significantly lower than that in the LPS group at the same time point. The difference was significant (P 0.01). Conclusion the high expression plasmid of KLF2 was constructed by using pEGFP-N3 plasmid vector with green fluorescent protein marker. The recombinant plasmid vector with high expression of pEGFP-N3-KLF2 was successfully constructed by sequencing. 2 LPs could significantly stimulate the expression of TF in THP-1. However, this induction can be inhibited by the high expression plasmid transfected with KLF2.
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1443235