發(fā)布時間：2018-01-17 01:25

  本文關(guān)鍵詞：肺炎鏈球菌PsaA抗原及其在結(jié)合疫苗中的應(yīng)用　出處：《蘇州大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：作為一種自然界廣泛存在的致病菌,肺炎鏈球菌可引起肺炎、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎和敗血癥等疾病。過去認(rèn)為肺炎鏈球菌莢膜多糖抗原為肺炎鏈球菌主要致病因子,近年來,隨著對肺炎鏈球菌致病機(jī)制的深入研究,發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌一些自身蛋白可能為肺炎鏈球菌致病因子,這些蛋白在所有臨床分離的肺炎鏈球菌菌株中均存在,可產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)作用,而且蛋白疫苗產(chǎn)生的是T細(xì)胞依賴性免疫反應(yīng),對成人和兒童均有很好的保護(hù)作用。將肺炎球菌自身蛋白作為載體與多糖偶聯(lián)制備蛋白多糖結(jié)合疫苗成為現(xiàn)在肺炎球菌疫苗的主要方向。目的:應(yīng)用基因工程技術(shù)在原核E. coli和真核畢赤酵母GS115兩種體系中表達(dá)和制備肺炎鏈球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesin A,PsaA),并與細(xì)菌莢膜多糖偶聯(lián)制備成多糖蛋白結(jié)合疫苗,探討PsaA作為肺炎球菌蛋白載體在結(jié)合疫苗中起到增強(qiáng)其它細(xì)菌多糖抗原免疫原性的同時,還能獲得抗肺炎球菌的抗體反應(yīng),從而達(dá)到用一種結(jié)合疫苗能誘導(dǎo)出針對兩種細(xì)菌的抗體免疫反應(yīng)的目的。方法:從肺炎鏈球菌基因組中擴(kuò)增psaA基因,將目的基因分別插入原核表達(dá)載體pET-28a(+)和真核表達(dá)載體pPIC9K,獲得非融合表達(dá)的重組質(zhì)粒pET28a-psaA和pPIC9K-psaA,通過轉(zhuǎn)化分別進(jìn)入大腸桿菌BL21和畢赤酵母GS115中,分別經(jīng)IPTG和甲醇誘導(dǎo),同采用DEAE-陰離子交換層析法純化基因重組rPsaA蛋白。經(jīng)過比較,將表達(dá)純化較好的rPsaA蛋白與A群腦膜炎莢膜多糖(Group A Meningococcal Polysaccharide, GAMP)偶聯(lián)成多糖蛋白結(jié)合疫苗后,用小鼠動物模型進(jìn)行免疫實驗,檢測該疫苗的免疫原性,用ELISA法測定該疫苗在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的針對肺炎球菌和腦膜炎球菌兩種病原菌特異性抗原的抗體水平。結(jié)果:在原核E. coli中成功克隆基因重組表達(dá)質(zhì)粒,而且表達(dá)的PsaA蛋白在載體上的組氨酸標(biāo)簽之前終止表達(dá),不帶有組氨酸標(biāo)簽,保證疫苗的安全性。SDS-PAGE技術(shù)分析表明:rPsaA蛋白高效表達(dá),約為菌體蛋白的60%,蛋白分子量約為37 kD,而且蛋白的可溶性好,不形成包涵體,用DEAE-陰離子交換層析法純化其純度可達(dá)80%以上。純化到的PsaA蛋白與GAMP多糖偶聯(lián)成功,應(yīng)用于小鼠免疫實驗,PsaA蛋白載體能顯著增強(qiáng)A群腦膜炎莢膜多糖抗原的免疫原性,并同時產(chǎn)生針對肺炎球菌蛋白抗原和腦膜炎球菌多糖抗原的特異性抗體。另外在真核畢赤酵母中也成功表達(dá)了rPsaA蛋白,目的蛋白表達(dá)量高達(dá)90%,純度約70%。結(jié)論:利用基因工程技術(shù)在原核表達(dá)體系和真核畢赤酵母體系中均成功獲得無組氨酸標(biāo)簽的rPsaA蛋白,并將它與A群腦膜炎莢膜多糖成功偶聯(lián),應(yīng)用于小鼠免疫實驗,在小鼠體內(nèi)PsaA蛋白載體能顯著增強(qiáng)A群腦膜炎莢膜多糖抗原的免疫原性,并同時產(chǎn)生針對肺炎球菌蛋白抗原和腦膜炎球菌多糖抗原的特異性抗體,提高疫苗的免疫保護(hù)效果。為探討給兒童接種一種疫苗能同時預(yù)防肺炎和腦膜炎兩種傳染病的可能性提供研究基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant plasmid pET28a - psaA ( PsaA ) , which has been used as a carrier and a polysaccharide conjugate vaccine , is used as carrier and the recombinant plasmid pET28a - psaA . The recombinant plasmid pET28a - psaA and psaA were isolated from Streptococcus pneumoniae . The recombinant expression plasmid of rPsaA protein was successfully cloned and purified by DEAE - anion exchange chromatography .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1435710