發(fā)布時(shí)間：2018-01-16 22:13

  本文關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌外排蛋白QacA的優(yōu)化表達(dá)研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：不同菌種對(duì)密碼子的偏好是影響重組蛋白表達(dá)的主要因素之一,本研究即是通過(guò)優(yōu)化密碼子的使用提高金黃色葡萄球菌主動(dòng)外排基因qacA在大腸桿菌中的表達(dá)水平。 方法：以重組質(zhì)粒pBluescript Ⅱ SK(+)/qacA為模板,通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出帶有Aatll和Nhel酶切位點(diǎn)的qacA基因,經(jīng)酶切、純化后用T4連接酶將其與同樣酶切過(guò)的pET-coco1載體連接；同時(shí)根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子,設(shè)計(jì)并合成密碼子優(yōu)化的qacA基因((oqacA),將合成的基因插入到pET-coco1載體中。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-coco1/oqacA及密碼子優(yōu)化的pET-coco1/oqacA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE分析表達(dá)情況,Western Blotting試驗(yàn)鑒定表達(dá)蛋白。最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定攜帶pET-coco1/oqacA菌株對(duì)消毒劑的耐受性。 結(jié)果：(1).酶切鑒定證實(shí)qac4基因及qacA基因已與原核表達(dá)載體pET-coco1連接,重組表達(dá)質(zhì)粒pET-coco1/qacA及密碼子優(yōu)化的pET-cocol/oqacA已構(gòu)建成功；(2).重組質(zhì)粒pET-coco1/qacA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后成功地表達(dá)了QacA蛋白,其分子量約為55千道爾頓；優(yōu)化后重組質(zhì)粒pET-co coco1/oqacA在大腸桿菌中高效表達(dá)；(3).Western Blotting試驗(yàn)顯示QacA表達(dá)蛋白與合成的特異性QacA一抗呈特異性免疫反應(yīng)；(4)MIC測(cè)定表明攜帶pET-coco1/oqacA菌株對(duì)消毒劑的耐受性與攜帶pET-coco1/qacA菌株相比無(wú)明顯變化,提示優(yōu)化后gacA表達(dá)正確。 結(jié)論：優(yōu)化后的pET-coco1/oqacA在大腸桿菌中得到高效表達(dá),為深入研究其結(jié)構(gòu)功能、設(shè)計(jì)有效外排抑制劑奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: the preference of codon among different strains is one of the main factors affecting the expression of recombinant protein. The purpose of this study was to improve the expression level of Staphylococcus aureus active efflux gene qacA in Escherichia coli by optimizing the use of codon. Methods: the recombinant plasmid pBluescript 鈪，

本文編號(hào)：1435050