本文關鍵詞：金黃色葡萄球菌外排蛋白QacA的優(yōu)化表達研究　出處：《重慶醫(yī)科大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的：不同菌種對密碼子的偏好是影響重組蛋白表達的主要因素之一,本研究即是通過優(yōu)化密碼子的使用提高金黃色葡萄球菌主動外排基因qacA在大腸桿菌中的表達水平。 方法：以重組質粒pBluescript Ⅱ SK(+)/qacA為模板,通過PCR方法擴增出帶有Aatll和Nhel酶切位點的qacA基因,經酶切、純化后用T4連接酶將其與同樣酶切過的pET-coco1載體連接；同時根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子,設計并合成密碼子優(yōu)化的qacA基因((oqacA),將合成的基因插入到pET-coco1載體中。重組表達質粒pET-coco1/oqacA及密碼子優(yōu)化的pET-coco1/oqacA轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導,SDS-PAGE分析表達情況,Western Blotting試驗鑒定表達蛋白。最低抑菌濃度(MIC)測定攜帶pET-coco1/oqacA菌株對消毒劑的耐受性。 結果：(1).酶切鑒定證實qac4基因及qacA基因已與原核表達載體pET-coco1連接,重組表達質粒pET-coco1/qacA及密碼子優(yōu)化的pET-cocol/oqacA已構建成功；(2).重組質粒pET-coco1/qacA轉化大腸桿菌BL21(DE3)經IPTG誘導后成功地表達了QacA蛋白,其分子量約為55千道爾頓；優(yōu)化后重組質粒pET-co coco1/oqacA在大腸桿菌中高效表達；(3).Western Blotting試驗顯示QacA表達蛋白與合成的特異性QacA一抗呈特異性免疫反應；(4)MIC測定表明攜帶pET-coco1/oqacA菌株對消毒劑的耐受性與攜帶pET-coco1/qacA菌株相比無明顯變化,提示優(yōu)化后gacA表達正確。 結論：優(yōu)化后的pET-coco1/oqacA在大腸桿菌中得到高效表達,為深入研究其結構功能、設計有效外排抑制劑奠定基礎。
[Abstract]:Objective: the preference of codon among different strains is one of the main factors affecting the expression of recombinant protein. The purpose of this study was to improve the expression level of Staphylococcus aureus active efflux gene qacA in Escherichia coli by optimizing the use of codon. Methods: the recombinant plasmid pBluescript 鈪，

本文編號：1435050