本文關(guān)鍵詞：用于組織工程骨成骨機(jī)制研究的小鼠模型的建立及其初步應(yīng)用　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景：臨床上因骨腫瘤、骨關(guān)節(jié)結(jié)核需手術(shù)廣泛切除，高能量創(chuàng)傷、化膿性骨關(guān)節(jié)炎等因素所致的大段骨缺損十分常見，以間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨被公認(rèn)為修復(fù)大節(jié)段骨缺損最有希望的策略之一。組織工程骨修復(fù)骨缺損的大量實(shí)驗(yàn)研究著重放在最終的成骨效果和推進(jìn)臨床前研究，而對于組織工程骨構(gòu)成要素之一的種子細(xì)胞的作用機(jī)制研究鮮有涉及，既往有些研究者推測，種子細(xì)胞MSCs在體內(nèi)主要是通過直接分化成骨來彌補(bǔ)宿主成骨能力的不足，從而促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，而在我們前期的研究中將骨組織工程的種子細(xì)胞MSCs通過綠色熒光標(biāo)記后進(jìn)行體內(nèi)示蹤，發(fā)現(xiàn)移植的MSCs雖可以參與成骨，但是在新生骨組織中大量的是宿主來源的成骨相關(guān)細(xì)胞，這提示有大量的宿主細(xì)胞遷移到組織工程骨移植部位參與成骨，因此我們提出種子細(xì)胞可能的修復(fù)機(jī)制：組織工程骨被移植到骨缺損部位后，局部創(chuàng)傷產(chǎn)生了炎癥，而釋放的炎癥因子刺激了種子細(xì)胞與宿主早期炎癥浸潤的單核細(xì)胞，它們產(chǎn)生了趨化因子和細(xì)胞因子，驅(qū)使宿主的成骨相關(guān)細(xì)胞募集遷移而來。動物模型是骨組織工程研究必要的載體，縱觀目前用于組織工程骨研究的各種動物模型，雖各有其優(yōu)勢但并不適合用于組織工程骨成骨機(jī)制的相關(guān)研究。 目的：(1)制備簡便易行的小鼠股骨干骨缺損模型，可用于骨組織工程機(jī)理研究；(2)MSCs作為種子細(xì)胞體外復(fù)合DBM材料構(gòu)建組織工程骨，觀察細(xì)胞在材料上的增殖、分化情況；(3)將構(gòu)建好的組織工程骨移植到小鼠骨缺損模型上，觀察種子細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)歸情況，驗(yàn)證模型的科學(xué)性和可行性。 方法：(1) MicroCT測量分析小鼠股骨的解剖參數(shù)。將30只2～3月齡FVB/N品系的小鼠分成3組，每組10只，用我們自行設(shè)計(jì)的內(nèi)固定物固定后分別制備長度為1mm、2mm和2.5mm的股骨干中段骨和骨膜缺損模型，術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)通過影像學(xué)和組織學(xué)的方法來觀察骨缺損的愈合進(jìn)程。(2)采用全骨髓細(xì)胞貼壁法分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過細(xì)胞表面的特異抗原標(biāo)志物和多向分化潛能來鑒定。(3)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室成熟的構(gòu)建方法，將綠色熒光小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mBMSCs)作為種子細(xì)胞同豬DBM構(gòu)建組織工程骨，掃描電鏡和激光共聚焦觀察細(xì)胞在DBM材料上的增殖、分化情況。(4)將普通型小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合DBM材料構(gòu)建的組織工程骨移植到綠色熒光小鼠雙側(cè)股骨干骨缺損模型上，兩側(cè)分別植入TEB和單純DBM材料進(jìn)行對照，利用小動物活體成像系統(tǒng)分別于術(shù)后第3天，7天，10天進(jìn)行觀察，觀察后將兩側(cè)標(biāo)本塊上的細(xì)胞消化下來行流式細(xì)胞儀分選和計(jì)數(shù)，對比兩組之間的差異，評價(jià)種子細(xì)胞是否募集了更多的宿主細(xì)胞參與局部骨缺損的修復(fù)，進(jìn)一步驗(yàn)證模型的有效性。 結(jié)果：(1)通過測量得到小鼠股骨的解剖參數(shù)：股骨長度（15.48±0.73）mm；股骨干中部橫徑（1.38±0.20）mm；矢狀徑（2.05±0.05）mm；髓腔直徑（0.75±0.80）mm,除去股骨髁和小轉(zhuǎn)子以上的部分，股骨干長度為8.5mm。建模術(shù)后第7、28、56、84天分別對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行鉬靶X線拍攝觀察，可見骨缺損長度為1mm的實(shí)驗(yàn)組：骨缺損術(shù)后第7d內(nèi)固定位置良好，骨缺損兩斷端對位對線良好，缺損端清晰銳利；骨缺損術(shù)后第28d內(nèi)固定物固定牢靠無移位，骨缺損端有纖維骨痂形成；第56d骨缺損處可見形成大量的骨痂，骨痂密度高；骨缺損術(shù)后第84d骨缺損處已有連續(xù)性骨痂通過，達(dá)到臨床愈合。骨缺損長度為2mm的實(shí)驗(yàn)組：術(shù)后第28d內(nèi)固定位置好，骨缺損端折線變得模糊；術(shù)后第84d骨缺損斷端變得圓鈍，骨痂生長不明顯。缺損長度為2.5mm的實(shí)驗(yàn)組：骨缺損術(shù)后連續(xù)觀察，內(nèi)固定位置良好，骨斷端無成角、短縮移位。術(shù)后84d，缺損處無明顯骨痂生長，斷端折線顯示較為銳利，可見類似軟組織影充填。組織學(xué)觀察術(shù)后84d，HE染色結(jié)果顯示，骨缺損長度為1mm的實(shí)驗(yàn)組缺損處可見大量的新生骨小梁組織填充，髓腔再通；骨缺損長度為2mm的實(shí)驗(yàn)組可見在一側(cè)的缺損骨端有少量成骨，缺損處纖維組織充填，纖維組織與骨端的邊界清楚；骨缺損長度為2.5mm的實(shí)驗(yàn)組可見缺損處充填著大量的纖維結(jié)締組織，無骨組織生成。(2)采用全骨髓細(xì)胞貼壁法分離的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，鏡下可見貼壁生長，呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測所培養(yǎng)第二代小鼠MSCs的細(xì)胞表型：MSCs特異性抗原CD105高表達(dá)（92.7%）；造血系抗原CD34和CD45低表達(dá)；內(nèi)皮細(xì)胞系抗原CD31低表達(dá)；病理特殊染色證實(shí)細(xì)胞具有向成骨、成脂分化的能力。(3)FVB/N品系的小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將其同豬DBM材料體外構(gòu)建TEB，通過激光共聚焦成像技術(shù)和掃描電鏡技術(shù)觀察到細(xì)胞種植到DBM材料上以后，隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞增殖分化良好，能夠在材料的表面和孔隙內(nèi)緊密貼附并伸出突觸，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞形態(tài)。(4)構(gòu)建雙側(cè)小鼠股骨缺損模型，無一例失敗，術(shù)后3d的股骨標(biāo)本大體觀無明顯差異，熒光成像觀察TEB組和DBM組股骨缺損處幾乎看不到綠色熒光；術(shù)后7d觀察股骨缺損處材料塊上兩組都有大量的細(xì)胞基質(zhì)，熒光成像可見TEB組和DBM組股骨缺損處局部可見明顯的綠色熒光表達(dá)，TEB組較DBM組熒光表達(dá)稍強(qiáng)。術(shù)后10d股骨標(biāo)本大體觀察兩組均可見缺損處材料上可見有纖維肉芽組織覆蓋，熒光成像顯示兩組股骨缺損處局部均具有顯著的熒光表達(dá)，，TEB組與DBM組對比熒光明顯較強(qiáng)烈，表明移植術(shù)后10d，TEB組較單純DBM組骨缺損處有更多宿主來源的綠色熒光細(xì)胞。小動物成像觀察結(jié)束后立即將材料塊上的細(xì)胞消化下來進(jìn)行流式細(xì)胞分選和計(jì)數(shù)，表明術(shù)后7天和10天，TEB實(shí)驗(yàn)組相比單純DBM組，表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞量顯著較多。 結(jié)論：(1)構(gòu)建的小鼠股骨干骨缺損模型在不填充任何材料的情況下，1mm的實(shí)驗(yàn)組能過通過自身修復(fù)愈合，而2mm以上的實(shí)驗(yàn)性骨缺損在術(shù)后3個月牢靠固定的情況下仍不能自行愈合，符合臨界骨缺損的標(biāo)準(zhǔn)，能夠滿足我們后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需求。(2)采用全骨髓細(xì)胞貼壁的方法分離培養(yǎng)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的增殖分化潛能，通過表面標(biāo)記物以及多向分化潛能鑒定證實(shí)是實(shí)驗(yàn)所需的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，(3)DBM材料具有天然的三維網(wǎng)孔骨結(jié)構(gòu)，大孔隙內(nèi)部雖有大量小孔隙相互連通，但孔徑仍相對較大，掃描電鏡圖像測量DBM的孔隙率約為76%，DBM材料具有良好的細(xì)胞相容性和孔隙率，細(xì)胞能夠在材料的表面和孔隙內(nèi)增殖分化良好，熒光標(biāo)記的細(xì)胞強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。(4)將FVB/N品系野生型小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建的組織工程骨和單純DBM支架材料移植到同品系綠色熒光小鼠雙側(cè)股骨缺損模型上，術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)，通過小動物成像技術(shù)、流式細(xì)胞分選等方法證明種子細(xì)胞MSCs能夠募集更多的宿主細(xì)胞參與骨缺損的修復(fù)，初步證實(shí)了該模型用于組織工程機(jī)制研究的可行性。
[Abstract]:Background : In clinic , the bone defects are common in bone tumor , osteoarticular tuberculosis requiring extensive resection , high energy trauma , suppurative osteoarthritis , etc . The bone graft in the bone graft is recognized as one of the most promising strategies for repairing segmental bone defects . Objective : ( 1 ) To prepare a simple and easy - to - do mouse femoral diaphysis defect model , which can be used in the research of bone tissue engineering mechanism ; ( 2 ) MSCs were used as seed cells in vitro to construct the tissue engineering bone , observe the proliferation and differentiation of the cells on the material ; ( 3 ) the constructed tissue engineering bone was transplanted into the mouse bone defect model , and the migration and transformation of the seed cells were observed , and the scientific nature and feasibility of the model were verified . Methods : ( 1 ) MicroCT was used to measure the anatomic parameters of bone defects in mice . Thirty rats 2 - 3 months old FVB / N strain were divided into three groups . Results : ( 1 ) In the experimental group , the length of the bone defect was 2 mm . ( 4 ) There was no significant difference between the two groups of bone defects in both groups . There was a significant difference in the fluorescence intensity of TEB group and the bone defect group . The fluorescence imaging showed that there were more host - derived green fluorescent cells in both the TEB group and the experimental group . Conclusion : ( 2 ) The bone marrow mesenchymal stem cells with bone marrow mesenchymal stem cells in the wild type of FVB / N strain have good cell compatibility and porosity .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R681;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1432162