本文關(guān)鍵詞：用于組織工程骨成骨機制研究的小鼠模型的建立及其初步應(yīng)用　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 骨髓間充質(zhì)干細胞 組織工程骨 遷移 成骨 動物模型 骨缺損

【摘要】：背景：臨床上因骨腫瘤、骨關(guān)節(jié)結(jié)核需手術(shù)廣泛切除，高能量創(chuàng)傷、化膿性骨關(guān)節(jié)炎等因素所致的大段骨缺損十分常見，以間充質(zhì)干細胞（MSC）為種子細胞構(gòu)建的組織工程骨被公認為修復(fù)大節(jié)段骨缺損最有希望的策略之一。組織工程骨修復(fù)骨缺損的大量實驗研究著重放在最終的成骨效果和推進臨床前研究，而對于組織工程骨構(gòu)成要素之一的種子細胞的作用機制研究鮮有涉及，既往有些研究者推測，種子細胞MSCs在體內(nèi)主要是通過直接分化成骨來彌補宿主成骨能力的不足，從而促進骨缺損的修復(fù)，而在我們前期的研究中將骨組織工程的種子細胞MSCs通過綠色熒光標記后進行體內(nèi)示蹤，發(fā)現(xiàn)移植的MSCs雖可以參與成骨，但是在新生骨組織中大量的是宿主來源的成骨相關(guān)細胞，這提示有大量的宿主細胞遷移到組織工程骨移植部位參與成骨，因此我們提出種子細胞可能的修復(fù)機制：組織工程骨被移植到骨缺損部位后，局部創(chuàng)傷產(chǎn)生了炎癥，而釋放的炎癥因子刺激了種子細胞與宿主早期炎癥浸潤的單核細胞，它們產(chǎn)生了趨化因子和細胞因子，驅(qū)使宿主的成骨相關(guān)細胞募集遷移而來。動物模型是骨組織工程研究必要的載體，縱觀目前用于組織工程骨研究的各種動物模型，雖各有其優(yōu)勢但并不適合用于組織工程骨成骨機制的相關(guān)研究。 目的：(1)制備簡便易行的小鼠股骨干骨缺損模型，可用于骨組織工程機理研究；(2)MSCs作為種子細胞體外復(fù)合DBM材料構(gòu)建組織工程骨，觀察細胞在材料上的增殖、分化情況；(3)將構(gòu)建好的組織工程骨移植到小鼠骨缺損模型上，觀察種子細胞的遷移和轉(zhuǎn)歸情況，驗證模型的科學(xué)性和可行性。 方法：(1) MicroCT測量分析小鼠股骨的解剖參數(shù)。將30只2～3月齡FVB/N品系的小鼠分成3組，每組10只，用我們自行設(shè)計的內(nèi)固定物固定后分別制備長度為1mm、2mm和2.5mm的股骨干中段骨和骨膜缺損模型，術(shù)后不同時相點通過影像學(xué)和組織學(xué)的方法來觀察骨缺損的愈合進程。(2)采用全骨髓細胞貼壁法分離培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，通過細胞表面的特異抗原標志物和多向分化潛能來鑒定。(3)根據(jù)本實驗室成熟的構(gòu)建方法，將綠色熒光小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞(mBMSCs)作為種子細胞同豬DBM構(gòu)建組織工程骨，掃描電鏡和激光共聚焦觀察細胞在DBM材料上的增殖、分化情況。(4)將普通型小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合DBM材料構(gòu)建的組織工程骨移植到綠色熒光小鼠雙側(cè)股骨干骨缺損模型上，兩側(cè)分別植入TEB和單純DBM材料進行對照，利用小動物活體成像系統(tǒng)分別于術(shù)后第3天，7天，10天進行觀察，觀察后將兩側(cè)標本塊上的細胞消化下來行流式細胞儀分選和計數(shù)，對比兩組之間的差異，評價種子細胞是否募集了更多的宿主細胞參與局部骨缺損的修復(fù)，進一步驗證模型的有效性。 結(jié)果：(1)通過測量得到小鼠股骨的解剖參數(shù)：股骨長度（15.48±0.73）mm；股骨干中部橫徑（1.38±0.20）mm；矢狀徑（2.05±0.05）mm；髓腔直徑（0.75±0.80）mm,除去股骨髁和小轉(zhuǎn)子以上的部分，股骨干長度為8.5mm。建模術(shù)后第7、28、56、84天分別對實驗小鼠進行鉬靶X線拍攝觀察，可見骨缺損長度為1mm的實驗組：骨缺損術(shù)后第7d內(nèi)固定位置良好，骨缺損兩斷端對位對線良好，缺損端清晰銳利；骨缺損術(shù)后第28d內(nèi)固定物固定牢靠無移位，骨缺損端有纖維骨痂形成；第56d骨缺損處可見形成大量的骨痂，骨痂密度高；骨缺損術(shù)后第84d骨缺損處已有連續(xù)性骨痂通過，達到臨床愈合。骨缺損長度為2mm的實驗組：術(shù)后第28d內(nèi)固定位置好，骨缺損端折線變得模糊；術(shù)后第84d骨缺損斷端變得圓鈍，骨痂生長不明顯。缺損長度為2.5mm的實驗組：骨缺損術(shù)后連續(xù)觀察，內(nèi)固定位置良好，骨斷端無成角、短縮移位。術(shù)后84d，缺損處無明顯骨痂生長，斷端折線顯示較為銳利，可見類似軟組織影充填。組織學(xué)觀察術(shù)后84d，HE染色結(jié)果顯示，骨缺損長度為1mm的實驗組缺損處可見大量的新生骨小梁組織填充，髓腔再通；骨缺損長度為2mm的實驗組可見在一側(cè)的缺損骨端有少量成骨，缺損處纖維組織充填，纖維組織與骨端的邊界清楚；骨缺損長度為2.5mm的實驗組可見缺損處充填著大量的纖維結(jié)締組織，無骨組織生成。(2)采用全骨髓細胞貼壁法分離的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，鏡下可見貼壁生長，呈典型的成纖維細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測所培養(yǎng)第二代小鼠MSCs的細胞表型：MSCs特異性抗原CD105高表達（92.7%）；造血系抗原CD34和CD45低表達；內(nèi)皮細胞系抗原CD31低表達；病理特殊染色證實細胞具有向成骨、成脂分化的能力。(3)FVB/N品系的小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞，將其同豬DBM材料體外構(gòu)建TEB，通過激光共聚焦成像技術(shù)和掃描電鏡技術(shù)觀察到細胞種植到DBM材料上以后，隨著時間的推移，細胞增殖分化良好，能夠在材料的表面和孔隙內(nèi)緊密貼附并伸出突觸，熒光強度逐漸增強，細胞呈成纖維細胞形態(tài)。(4)構(gòu)建雙側(cè)小鼠股骨缺損模型，無一例失敗，術(shù)后3d的股骨標本大體觀無明顯差異，熒光成像觀察TEB組和DBM組股骨缺損處幾乎看不到綠色熒光；術(shù)后7d觀察股骨缺損處材料塊上兩組都有大量的細胞基質(zhì)，熒光成像可見TEB組和DBM組股骨缺損處局部可見明顯的綠色熒光表達，TEB組較DBM組熒光表達稍強。術(shù)后10d股骨標本大體觀察兩組均可見缺損處材料上可見有纖維肉芽組織覆蓋，熒光成像顯示兩組股骨缺損處局部均具有顯著的熒光表達，，TEB組與DBM組對比熒光明顯較強烈，表明移植術(shù)后10d，TEB組較單純DBM組骨缺損處有更多宿主來源的綠色熒光細胞。小動物成像觀察結(jié)束后立即將材料塊上的細胞消化下來進行流式細胞分選和計數(shù)，表明術(shù)后7天和10天，TEB實驗組相比單純DBM組，表達綠色熒光的細胞量顯著較多。 結(jié)論：(1)構(gòu)建的小鼠股骨干骨缺損模型在不填充任何材料的情況下，1mm的實驗組能過通過自身修復(fù)愈合，而2mm以上的實驗性骨缺損在術(shù)后3個月牢靠固定的情況下仍不能自行愈合，符合臨界骨缺損的標準，能夠滿足我們后續(xù)的實驗需求。(2)采用全骨髓細胞貼壁的方法分離培養(yǎng)的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞具有良好的增殖分化潛能，通過表面標記物以及多向分化潛能鑒定證實是實驗所需的骨髓間充質(zhì)干細胞，(3)DBM材料具有天然的三維網(wǎng)孔骨結(jié)構(gòu)，大孔隙內(nèi)部雖有大量小孔隙相互連通，但孔徑仍相對較大，掃描電鏡圖像測量DBM的孔隙率約為76%，DBM材料具有良好的細胞相容性和孔隙率，細胞能夠在材料的表面和孔隙內(nèi)增殖分化良好，熒光標記的細胞強度逐漸增強。(4)將FVB/N品系野生型小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞構(gòu)建的組織工程骨和單純DBM支架材料移植到同品系綠色熒光小鼠雙側(cè)股骨缺損模型上，術(shù)后不同時相點，通過小動物成像技術(shù)、流式細胞分選等方法證明種子細胞MSCs能夠募集更多的宿主細胞參與骨缺損的修復(fù)，初步證實了該模型用于組織工程機制研究的可行性。
[Abstract]:Background : In clinic , the bone defects are common in bone tumor , osteoarticular tuberculosis requiring extensive resection , high energy trauma , suppurative osteoarthritis , etc . The bone graft in the bone graft is recognized as one of the most promising strategies for repairing segmental bone defects . Objective : ( 1 ) To prepare a simple and easy - to - do mouse femoral diaphysis defect model , which can be used in the research of bone tissue engineering mechanism ; ( 2 ) MSCs were used as seed cells in vitro to construct the tissue engineering bone , observe the proliferation and differentiation of the cells on the material ; ( 3 ) the constructed tissue engineering bone was transplanted into the mouse bone defect model , and the migration and transformation of the seed cells were observed , and the scientific nature and feasibility of the model were verified . Methods : ( 1 ) MicroCT was used to measure the anatomic parameters of bone defects in mice . Thirty rats 2 - 3 months old FVB / N strain were divided into three groups . Results : ( 1 ) In the experimental group , the length of the bone defect was 2 mm . ( 4 ) There was no significant difference between the two groups of bone defects in both groups . There was a significant difference in the fluorescence intensity of TEB group and the bone defect group . The fluorescence imaging showed that there were more host - derived green fluorescent cells in both the TEB group and the experimental group . Conclusion : ( 2 ) The bone marrow mesenchymal stem cells with bone marrow mesenchymal stem cells in the wild type of FVB / N strain have good cell compatibility and porosity .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R681;R-332

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳雪暉;羅飛;謝肇;許建中;;組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損的研究現(xiàn)狀及進展[J];創(chuàng)傷外科雜志;2008年02期

2 劉杰,許建中,王序全,羅飛;脫鈣骨基質(zhì)支架構(gòu)建組織工程骨的實驗研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年09期

3 李強;何清義;許建中;侯天勇;王序全;曾琳;馮江華;;羊脫鈣骨基質(zhì)作為骨組織工程支架材料的性能評估[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2007年01期

4 劉杰;吳雪暉;羅飛;何清義;代飛;謝肇;許建中;;自體間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程骨修復(fù)人長骨缺損的臨床觀察[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年09期

5 彭吾訓(xùn);王蕾;鄧進;李彥林;龔躍昆;李世和;;一種組織工程骨修復(fù)兔股骨頭壞死模型的效果評價[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2010年07期

6 李明善,王葆芳,皇甫超申;微孔對同種異體表面脫鈣骨基質(zhì)明膠誘導(dǎo)成骨能力的影響[J];解剖學(xué)研究;2001年01期

7 楊為中,周大利,尹光福,陳槐卿,肖斌,張云;新型多孔磷灰石/硅灰石生物活性玻璃陶瓷材料的研究[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2004年06期

8 楊柳;加強軟骨與骨組織工程中關(guān)鍵技術(shù)的應(yīng)用[J];中華實驗外科雜志;2005年03期

9 魏寬海,裴國獻,鄭磊,王前,金丹,胡罷生;地塞米松對骨髓基質(zhì)細胞生物學(xué)特性的影響[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2001年04期

10 許建中;;骨組織工程相關(guān)研究新進展[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2010年07期

本文編號：1432162