本文關鍵詞：心臟細胞療法：致瘤性評估與旁分泌機制探索　出處：《南京醫(yī)科大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景： 自從干細胞被發(fā)現(xiàn)以來,許多學者致力于研究如何通過干細胞移植治療各種心臟疾病導致的終末期心力衰竭。近年來,該領域出現(xiàn)了兩大重要進展。其一,是出現(xiàn)了新的干細胞來源——誘導的多潛能干細胞(induced pluripotent stem cell, iPS細胞)；其二,是發(fā)現(xiàn)了干細胞療法的新的作用機制——旁分泌機制。本論文分三個部分,分別研究iPS細胞和旁分泌機制在心臟的干細胞療法中的應用。 由于iPS細胞的重編程誘導過程本身使其具有致瘤可能,因此,要將iPS細胞應用于臨床,應警惕其致瘤風險。我們在本文的第一部分評估了經(jīng)心肌移植未分化iPS細胞在未受免疫抑制的同種異基因受體中是否會形成腫瘤。 越來越多的證據(jù)提示,干細胞移植治療心臟疾病所獲得的效果,并非得益于干細胞的原位再生,而是來自于移植細胞通過旁分泌作用對心臟宿主細胞的影響。心肌細胞是心臟中占體積最大的細胞,是心臟功能的主要執(zhí)行者；心臟成纖維細胞(cardiac fibroblast, CF)是心臟中占數(shù)量最多的細胞,在心臟結構重構和電學重構過程中起重要作用。我們在本文的第二部分和第三部分,分別探索了干細胞通過其旁分泌機制,對這兩種心臟宿主細胞的作用。 成年哺乳動物的心臟長期以來被認為是終末分化器官。然而,近來發(fā)現(xiàn)成年心臟也能夠進行心肌細胞更新。因此,細胞衰老可能在心臟衰老的病理過程中起到重要作用。在本文第二部分,我們探索了干細胞是否能夠通過旁分泌機制抑制心肌的細胞衰老。 在動物模型中,骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcell, BM-MSC)移植能夠減弱心臟纖維化；體外研究發(fā)現(xiàn),這種抗纖維化作用可能來自于MSC分泌的旁分泌因子對細胞外基質的直接作用,或來自于MSC通過旁分泌作用抑制CF的增殖并下調其膠原合成能力的間接作用。另外,動物實驗和臨床研究表明,MSC移植能夠維持心臟的電學穩(wěn)定。為了探索MSC移植改善心臟結構重構和電學重構的機制,我們在本文的第三部分,研究了MSC通過旁分泌對CF的表型、功能與電學特征的影響。 方法： 第一部分中,我們以未受免疫抑制的同種異基因大鼠為受體,其中包括心梗大鼠與正常大鼠,經(jīng)心肌向其移植大鼠iPS細胞系M13細胞。細胞劑量分別為2×104、2×105和2×106；移植時間分別2、4和6周。我們通過蘇木素-伊紅染色的組織學檢查分析腫瘤形成率和分化情況。 第二部分中,我們收集iPS細胞在正常條件和氧化應激條件下的培養(yǎng)上清液作為大鼠心肌來源細胞系H9c2細胞的條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM)。我們使用經(jīng)CM處理或無CM處理的H9c2細胞通過缺氧／復氧來誘導其發(fā)生細胞衰老。 第三部分中,我們將成人心室成纖維細胞(human cardiac fibroblasts-adult ventricle, HCF-av)進行體外血清饑餓培養(yǎng),模擬以缺血缺氧為主的心臟病理環(huán)境。然后將人類BM-MSC (human BM-MSC, hBM-MSC)與HCF-av進行非接觸式共培養(yǎng),檢測hBM-MSC通過旁分泌作用對HCF-av的細胞表型標志物、細胞外基質和縫隙連接蛋白在mRNA水平表達的影響。此外,我們分析了HCF-av鈉離子通道和鉀離子通道的表達譜及其變化。 結果： 1.未分化的大鼠iPS細胞會在心內和心外區(qū)域生成異質性腫瘤。移植的細胞劑量、移植時間以及受體大鼠心梗與否對腫瘤發(fā)生率無顯著影響。 2.iPS細胞來源的CM能夠減弱H9c2細胞中衰老相關p-半乳糖苷酶的活性,降低G1細胞周期阻滯,并減少衰老標志基因p16INK4a、p21Wafl/Cip1和p53的表達。而且iPS來源的CM較H9c2來源的CM含有更高濃度的營養(yǎng)因子。 3. hBM-MSC皂夠通過旁分泌作用,上調HCF-av中平滑肌細胞肌動蛋白a (alpha smooth muscle actin, a-SMA)和胸腺細胞分化抗原1(thymocyte differentiation antigen1, THY-1, CD90)的表達；下調多種細胞外基質的表達,包括Ⅰ型膠原、纖連蛋白、腱糖蛋白C、層粘連蛋白和基質金屬蛋白酶組織抑制劑1；并下調縫隙蛋白40(Connexin40, CX40)、CX43和CX45的表達。Nav1.5和Nav1.7是HCF-av中表達的主要鈉離子通道。其中Nav1.5在病理狀態(tài)下表達上調, hBM-MSC能通過旁分泌作用抑制這種病理性上調；而Navl.7的表達較穩(wěn)定。HVF-av表達的主要鉀離子通道包括：Kv1.3、Kv1.5、Kv4.2. Kv4.3、Kca1.1、Kca3.1、Kir2.1、Kir2.3、Kir6.1和Kir6.2。它們均在病理狀態(tài)下表達上調。hBM-MSC能通過旁分泌作用抑制這種病理性上調。Kv7.1、Kv11.1和Kir4.1在HCF-av中無表達或表達很低。 結論： 1.在心臟內行同種異基因移植iPS細胞會導致原位腫瘤形成。此外,從搏動心臟中漏出的細胞可能成為腫瘤播散的潛在來源。 2.iPS細胞分泌的旁分泌因子能夠通過抑制p53-p21wafl/Cip1和P16INK4a-pRb通路,延緩H9c2細胞受應激誘導后發(fā)生細胞衰老。而雕iPS細胞經(jīng)受氧化應激后仍能保持上述防細胞衰老的旁分泌作用。 3.MSC移植對心臟結構重構和電學重構的改善,可能是通過其旁分泌效應起作用的,且其具體的作用機制可能包括以下幾點：1)減少細胞外基質過量沉積；2)提高CF修補心臟損傷的能力與效率,避免其過量增殖,抑制心臟纖維化；3)減弱CF與心肌細胞的病理性耦聯(lián),抑制其對心肌細胞電生理特性的影響；4)恢復CF本身的膜電流特性。 意義： 1.本文首次報道了iPS細胞行同種異基因心肌內移植致腫瘤形成,強調了在將iPS細胞用于心臟疾病的治療前,應進行嚴格的安全評估。 2.本文首次報道了干細胞療法的抗細胞衰老作用,這種作用可能成為治療衰老相關心血管疾病的嶄新治療策略。 3.本文首次在人類細胞中證明MSC對CF的旁分泌作用；也是首次提出MSC可以通過對CF的旁分泌作用改善心臟的電學重構。
[Abstract]:Background:
Since the stem cells are found, many scholars dedicated to the study of how the stem cell transplantation for the treatment of various heart diseases resulting in end-stage heart failure. In recent years, the emergence of two important progress. One is the emergence of a new source of stem cells, induced pluripotent stem cells (induced pluripotent multi submersible stem cell, iPS cell; second,) is the discovery of the new stem cell therapy mechanism of paracrine mechanism. This paper is divided into three parts, respectively, of iPS cells and secretion mechanism in the next application of stem cell therapy in the heart.
Due to the reprogramming of iPS cells induced by the process itself has the tumorigenic may, therefore, to iPS cells in clinical application, we should be aware of the tumorigenic risk. In the first part of this paper we evaluated the transplantation of undifferentiated iPS cells in allogeneic without immune suppression by whether the formation of tumors in the body.
More and more evidence suggests that stem cell transplantation for the treatment of heart disease result is not due to the in situ regeneration of stem cells, but from the transplanted cells secrete effect on host cells by paracrine. Cardiac myocardial cells is accounted for the largest volume of the cells in the heart, is mainly the implementation of cardiac function; cardiac fibroblast cells (cardiac fibroblast CF) is accounted for the largest number of cells in the heart, play an important role in cardiac structural remodeling and electrical remodeling process. We are in the second part and the third part of this paper, respectively explore the stem cells through paracrine mechanisms of the two kinds of heart host cells.
The adult mammalian heart has long been thought to be terminally differentiated organs. However, recently found that adult heart is also capable of myocardial cell renewal. Therefore, play an important role in the pathological process of cell senescence may be in the heart of aging. In the second part of this paper, we explore whether stem cells through paracrine mechanism of inhibiting myocardial cell aging.
In an animal model of bone marrow mesenchymal stem cells (bone marrow-derived mesenchymal stemcell, BM-MSC) transplantation can attenuate myocardial fibrosis; in vitro, anti fibrosis effect of this may come from the MSC secretion of paracrine factors on extracellular matrix directly, or indirectly from MSC by paracrine inhibition of CF the proliferation and down regulate collagen synthesis ability. In addition, animal experiments and clinical studies showed that MSC transplantation can maintain stable electrical heart. In order to explore the mechanism of MSC transplantation improves cardiac structural remodeling and electrical remodeling, we in the third part of this paper, MSC was studied by paracrine phenotype of CF, affecting the function and electrical characteristics.
Method錛，

本文編號：1428155