發(fā)布時間：2018-01-14 04:17

  本文關(guān)鍵詞：雜合抗菌肽MLH在大腸埃希菌中的融合表達(dá)及其抑菌活性研究　出處：《中國病原生物學(xué)雜志》2017年08期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的設(shè)計合成雜合肽MLH基因并在大腸埃希菌(Escherichia coli)表達(dá)系統(tǒng)中高效融合表達(dá),獲得具有抑菌活性的重組蛋白。方法以家蠅抗菌肽Md-Cec、人源抗菌肽LL-37和幽門螺桿菌肽Hp為母體肽,通過生物信息學(xué)分析篩選出一條具有抗菌潛力的新型雜合抗菌肽MLH并根據(jù)E.coli密碼子的偏好性編碼基因。采用重疊延伸基因擴(kuò)增(SOE-PCR)技術(shù),通過設(shè)計合成3條互補(bǔ)引物合成所需的目的基因,與表達(dá)載體pET-32a(+)連接后轉(zhuǎn)化至E.coli表達(dá)菌株BL21(DE3),構(gòu)建基因工程菌pET-32a-MLH/BL21(DE3),用含氨芐青霉素(Amp)的抗性平板篩選陽性菌株,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后采用SDS-PAGE電泳和Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)。對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以獲得融合蛋白的大量表達(dá),采用Ni 2+親和層析柱純化和透析復(fù)性的方法將表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行純化和復(fù)性,獲取具有活性的融合蛋白,采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法測定其抑菌活性。結(jié)果成功合成基因MLH并與表達(dá)載體連接形成重組質(zhì)粒pET-32a-MLH,構(gòu)建重組基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)相對分子質(zhì)量單位(Mr)約25×10~3的重組蛋白且主要以包涵體形式存在。對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最優(yōu)發(fā)酵條件為:IPTG終濃度為1.0mmol/L;誘導(dǎo)時間為4h;誘導(dǎo)溫度為37℃。通過純化以及復(fù)性處理得到重組蛋白對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑制作用。結(jié)論雜合抗菌肽MLH可在大腸埃希菌中融合表達(dá)且有一定抑菌活性。
[Abstract]:Objective to synthesize hybrid peptide MLH gene in Escherichia coli (Escherichia coli) expression system, fusion expression, recombinant protein with antibacterial activity. Methods the recombinant antibacterial peptide Md-Cec, human antimicrobial peptide LL-37 and Helicobacter pylori peptide Hp as parent peptide, through bioinformatic analysis identified a the antimicrobial potential novel hybrid antibacterial peptide MLH and according to the preference of the gene encoding the E.coli codon. Using PCR overlap extension (SOE-PCR) technology, the design and synthesis of 3 complementary primers required for the synthesis of the target gene, and the expression vector pET-32a (+) connection was transformed into E.coli expression strain BL21 (DE3) and the construction of recombinant strain pET-32a-MLH/BL21 (DE3), containing ampicillin (Amp) screening positive strain resistance plate, the isopropyl thiogalactoside beta -D- (IPTG) induced by SDS-PAGE electrophoresis and Western blot detection. The expression of protein. To optimize the fermentation conditions to obtain the massive expression of fusion protein by Ni method, 2+ affinity chromatography purification and renaturation of the expressed fusion protein was purified and refolded, obtain the activity of fusion protein by agar hole diffusion method determined the antibacterial activity. The successful synthesis of gene MLH and connected with the carrier to form recombinant plasmid pET-32a-MLH expression, recombinant gene engineering strain pET-32a-MLH/BL21 (DE3), the expression of relative molecular mass unit induced by IPTG (Mr) about 25 * 10~3 and the recombinant protein mainly existed in inclusion bodies. The fermentation conditions were optimized, to determine the optimal fermentation conditions were: IPTG concentration 1.0mmol/L the induction time is 4H; induction; the temperature of 37 DEG. Purification and renaturation of recombinant protein was inhibited by Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were passed. Conclusion Heterozygous antibacterial peptide MLH can be expressed in Escherichia coli and has certain inhibitory activity.

【作者單位】： 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院;西安市微生物藥物工程實驗室;
【基金】：陜西省教育廳自然科學(xué)研究專項(No.14JK1101)
【分類號】：R3416
【正文快照】： ***sion The hybrid antimicrobial peptide MLH can be expressed in E.coli and it has a marked bacteriostatic effect on S.aureus and B.subtilis.抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)是一類廣泛存在于自然界生物體中的小分子多肽,是生物免疫系統(tǒng)的主要組成部分[1-2]。由

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本文編號：1421985