本文關(guān)鍵詞：參與先天性免疫應(yīng)答的miRNA的鑒定及其功能的初步研究　出處：《安徽大學(xué)》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：microRNA (miRNA)是一類由基因組編碼的長度為18-26個核苷酸的單鏈非編碼小RNA,它們廣泛存在于真核細胞中,在進化上高度保守。在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下,miRNA以前體的形式從基因組中轉(zhuǎn)錄出來。它的形成過程涉及一系列蛋白分子對其轉(zhuǎn)錄前體的剪切和轉(zhuǎn)運,最終成熟的miRNA在細胞質(zhì)中與其它相關(guān)蛋白分子一起構(gòu)成沉默復(fù)合體(RISC),通過與靶mRNA分子的3’UTR中相應(yīng)序列的結(jié)合,導(dǎo)致靶mRNA的降解或者轉(zhuǎn)錄后翻譯受到抑制。到目前為止,已在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)上萬種的miRNA,它們構(gòu)成了一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),參與細胞增殖分化、生物體發(fā)育、機體免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生等生理及病理過程。 當病原微生物入侵時,機體的先天性免疫應(yīng)答會被迅速激活,并通過其介導(dǎo)的炎癥和抗病毒反應(yīng)來殺滅和清除病原微生物。NF-κB是先天性免疫應(yīng)答過程中的一個重要信號通路,當它被激活時,能夠啟動下游一系列細胞因子的轉(zhuǎn)錄,從而促進機體的炎癥反應(yīng)的發(fā)生,與此同時先天性免疫應(yīng)答誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ⅰ型干擾素在機體的抗病毒反應(yīng)中也發(fā)揮了重要作用。宿主的抗感染先天性免疫應(yīng)答一方面要產(chǎn)生足夠強烈的炎癥反應(yīng)以徹底消滅入侵的病原微生物,另一方面又要防止這一反應(yīng)的過度激活而對機體本身帶來的損傷。在這一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,存在著許多正負調(diào)控因子,以保障機體先天性免疫應(yīng)答的適度激活。越來越多的文獻報道m(xù)iRNA參與了先天性免疫應(yīng)答,并發(fā)揮重要的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)和鑒定參與調(diào)控先天性免疫應(yīng)答的miRNA及對其分子機制的研究,可以加深對宿主先天性免疫應(yīng)答調(diào)控的理解,為研制抗感染藥物提供新的靶標。 在本課題中,我們初步鑒定出了38種可能調(diào)控先天性免疫應(yīng)答信號通路的miRNA,并對其中的miR-526a、miR-617和miR-623進行了進一步的功能研究。 1高通量篩選參與先天性免疫應(yīng)答的miRNA: 通過IFNβ和IL-1p(NF-κB調(diào)控的細胞因子)的檢測平臺,對140個miRNA進行篩選,從中鑒定出了38種參與先天性免疫應(yīng)答的功能miRNA。其中21種能夠上調(diào)IFNβ的表達水平,22種能夠上調(diào)IL-1p的表達水平。 2miR-526a在先天性免疫應(yīng)答中功能的初步研究： 通過熒光素酶報告基因和酶聯(lián)免疫吸附試驗發(fā)現(xiàn),miR-526a能夠明顯上調(diào)IFNp和IL-1p的表達水平。因此,我們進一步研究了miR-526a在宿主先天性免疫應(yīng)答中的作用。通過熒光定量PCR的方法,我們發(fā)現(xiàn)在VSV和LPS誘導(dǎo)THP-1細胞的過程中,miR-526a的表達水平隨著時間的變化逐漸增強,這說明miR-526a可能參與了病原體感染的宿主免疫應(yīng)答。接下來,通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測到CYLD可能是miR-526a的靶點。通過熒光定量PCR的方法,我們發(fā)現(xiàn)細胞中過表達miR-526a能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上抑制CYLD的表達。CYLD是一個去泛素化酶,能夠通過對RIG-I的去泛素化作用抑制RIG-I的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；同時它還能夠通過與MyD88的相互作用抑制其對下游分子的磷酸化進而負調(diào)控TLR4信號通路,從而下調(diào)宿主先天性免疫應(yīng)答水平。上述結(jié)果初步證明miR-526a可能通過負調(diào)控CYLD的表達水平促進IFNp和IL-1β的產(chǎn)生。 3參與炎癥反應(yīng)的miR-617和miR-623在腫瘤發(fā)生中功能的初步研究： 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗發(fā)現(xiàn),miR-617和miR-623能夠明顯上調(diào)IL-1β的表達水平,而IL-1p是受NF-κB調(diào)控的最重要的細胞因子之一。NF-κB信號通路在先天性免疫促炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。大量研究表明,在腫瘤的發(fā)生過程中,常伴有NF-κB信號通路特征性的表達變化,其中炎癥相關(guān)分子參與了腫瘤的發(fā)生,并在腫瘤形成的不同階段起著決定性的作用。IL-1p是一個前炎癥因子,它介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的微環(huán)境能夠?qū)е抡＜毎蛔兺瑫r促進細胞的增殖。其它相關(guān)課題的研究中發(fā)現(xiàn),miR-617和miR-623在乳腺癌發(fā)生過程中表達增高,因此我們探討了miR-617和miR-623在乳腺癌發(fā)生中的作用。通過細胞計數(shù)和劃痕實驗,我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞系ZR-75-1中過表達miR-617和miR-623能夠?qū)е履[瘤細胞增殖和遷移能力的顯著增加。上述結(jié)果表明miR-617和miR-623可能通過影響細胞的炎癥反應(yīng)參與腫瘤的發(fā)生,為我們進一步研究miR-617和miR-623的功能打下了基礎(chǔ)。 綜上所述,本課題初步鑒定了38種可能參與先天性免疫應(yīng)答的miRNA,進一步研究表明,miR-526a可能通過抑制負調(diào)控因子CYLD從而上調(diào)IFNβ和IL-1β的表達水平；此外參與炎癥反應(yīng)的miR-617和miR-623能夠促進腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。這些研究為進一步揭示miRNA在先天性免疫應(yīng)答及炎癥介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生中的分子機制提供了重要線索。
[Abstract]:MicroRNA (miRNA) is a class of single stranded genome by encoding length 18-26 nucleotides encoding non small RNA, which widely exists in eukaryotic cells, highly conserved in evolution. In the RNA polymerase II or III under the action of miRNA before the form from the genome to record its forming process. To cut and transport of a series of proteins of the transcripts, eventually mature miRNA in the cytoplasm and other related protein molecules together constitute the silencing complex (RISC), by combining the corresponding sequence and the target molecule mRNA 3 'UTR, leading to the target mRNA degradation or translation after transcription inhibition to the current. So far, thousands of miRNA have been found in the organism, they constitute a complex regulatory network involved in cell proliferation and differentiation, organism development, immune response and tumorigenesis of physiological and pathological process.
When the invasion of pathogenic microorganisms, the body's innate immune response will be rapidly activated, inflammation and antiviral responses and through its mediated to sterilize and remove pathogenic microorganisms of.NF- kappa B is an important signaling pathway in the innate immune response, when it is activated, can activate the downstream transcription of a series of cells factor, so as to promote the body's inflammatory response occurred at the same time, type I interferon induced innate immune response in antiviral responses also played an important role in anti infection. The host innate immune response to a strong enough to produce inflammation completely destroy invading pathogenic microorganisms, on the other hand to prevent this reaction caused excessive activation of the body itself damage. In the signal transduction process, there are a lot of positive and negative regulatory factors, in order to safeguard the innate Moderate activation of immune response. More and more reports of miRNA involved in the innate immune response, and play an important role. The discovery and study of identification is involved in the regulation of the innate immune response of miRNA and its molecular mechanism, can deepen our understanding of the host innate immune response regulation understanding for anti infection drugs provide a new target.
In this study, we initially identified 38 kinds of miRNA that might regulate the signal transduction pathway of congenital immune response, and further studied the functions of miR-526a, miR-617 and miR-623.
1 high throughput screening of miRNA: involved in congenital immune response
Through the detection platform of IFN beta and IL-1p (NF- kappa B regulated cytokines), 140 miRNA were screened, and 38 kinds of functional miRNA. participating in innate immune response were identified. 21 of them could upregulate the expression level of IFN beta, and 22 of them could upregulate IL-1p expression level.
Preliminary study on the function of 2miR-526a in the innate immune response:
By luciferase assay and enzyme-linked immunosorbent assay showed that miR-526a expression levels were significantly up-regulated the expression of IFNp and IL-1p. Therefore, we further study the role of miR-526a in innate immune response. By fluorescence quantitative PCR method, we found that the process of THP-1 cells induced by VSV and LPS, the expression level of miR-526a enhanced gradually with the change of time, indicating that miR-526a may be involved in the host immune response to pathogen infection. Then, through the method of bioinformatics to predict CYLD may be the target of miR-526a. By fluorescence quantitative PCR method, we found that cells overexpressing miR-526a could inhibit the expression of.CYLD CYLD in the level of transcription and translation is a deubiquitinating enzyme, can go through ubiquitination of RIG-I inhibition of RIG-I signal transduction; at the same time it can also pass and MyD88 Interaction inhibits the phosphorylation of downstream molecules, thereby negatively regulates the TLR4 signaling pathway, thereby reducing the level of host innate immune response. The above results preliminarily prove that miR-526a may promote IFNp and IL-1 beta production by negatively regulating the expression level of CYLD.
3 preliminary studies on the function of miR-617 and miR-623 involved in inflammatory reactions in the carcinogenesis:
By ELISA, miR-617 and miR-623 expression of IL-1 beta, and IL-1p is one of the most important cytokines.NF- B signaling pathway by NF- kappa B regulation plays an important role in the inflammatory reaction in innate immunity and promoting. A large number of studies show that, in the process of tumor, often accompanied by changes in the expression characteristics of NF- kappa B signaling pathway, in which inflammation related molecules involved in tumor development, tumor formation in different stages and plays a decisive role in.IL-1p is a proinflammatory cytokine, microenvironment generated inflammation mediated can cause normal cells to promote cell proliferation and mutation study found. Other relevant subjects, the expression of miR-617 and miR-623 in the process of breast cancer increased, so we investigate the role of miR-617 and miR-623 in breast cancer cells through. Counting and scratch test, we found that overexpression of miR-617 and miR-623 resulted in a significant increase in tumor cell proliferation and migration in breast cancer cell line ZR-75-1. The results showed that miR-617 and miR-623 may occur through the effect of inflammatory cells in the tumor, for us to further study the function of miR-623 and the miR-617 foundation.
To sum up, this paper identified 38 may be involved in the innate immune response of miRNA, further study showed that miR-526a could inhibit the expression by negative regulation factor CYLD and upregulation of IFN beta and IL-1 beta; also involved in inflammatory reaction of miR-617 and miR-623 can promote the growth and metastasis of tumor. In these studies provide important clues in order to further reveal the molecular mechanism of miRNA in innate immune response and inflammation mediated tumorigenesis.

【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

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本文編號：1421023