本文關鍵詞：微囊藻毒素-LR對中國倉鼠卵巢細胞的氧化應激和凋亡作用　出處：《鄭州大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：微囊藻毒素(Microcystins, MCs)是由藍藻細菌產(chǎn)生的一類單環(huán)7肽生物毒素,已發(fā)現(xiàn)80多種異構(gòu)體,其中最常見、研究較深入的是微囊藻毒素-LR(MC-LR). MCs可通過食物鏈及飲水進入人體,嚴重威脅人類的生命和健康。 性腺是MCs的第2靶器官,有研究證明MCs具有生殖毒性。但是,目前關于MCs誘導生殖系統(tǒng)尤其是雌性生殖系統(tǒng)損傷方面的資料還不多,其致毒機制也不確定。而有研究發(fā)現(xiàn)MC-LR可以在卵中大量存在并傳遞至后代,而且MC-LR具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾作用,能對魚類和哺乳動物細胞發(fā)揮雌激素樣作用。因此,研究MC-LR對雌性生殖系統(tǒng)的毒性作用具有重要意義。 本研究以中國倉鼠卵巢(CHO)細胞為模型,經(jīng)MC-LR暴露后,檢測CHO細胞活性的變化,及細胞內(nèi)活性氧、抗氧化酶、脂質(zhì)過氧化水平,線粒體膜電位,天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性和細胞凋亡率的變化,從分子水平探討MC-LR對CHO細胞的毒性作用,為闡明MC-LR的生殖毒性作用提供理論基礎。 方法： 1.建立傳代培養(yǎng)的CHO細胞模型。 2.用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法檢測MC-LR對CHO細胞活性的影響：不同濃度的MC-LR(0μg/ml,1μig/ml,5μg/ml,10μg/ml15μg/ml)處理CHO細胞24h后,用MTT染色,測各組吸光度,計算細胞活性。 3.集落形成實驗：用不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml)處理CHO細胞24h,計算各組集落形成能力,評價MC-LR對單個CHO細胞增殖能力的影響。 4.檢測MC-LR對CHO細胞中過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)的影響：用不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細胞,24h后收集細胞,用2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽(DCFH-DA)法測定ROS,硫代巴比妥酸(TBA)法測定MDA,可見分光光度法測定CAT。 5.線粒體膜電位檢測試劑盒檢測不同劑量MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/m1)染毒24h后CHO細胞線粒體膜電位的變化。 6. Caspase-3底物切除法檢測MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)對CHO細胞中caspase-3性的影響。 7.膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染色結(jié)合流式細胞術檢測不同濃度的MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)染毒24h后細胞凋亡率的變化。 結(jié)果： 1. MC-LR(0μg/ml,1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,15μg/ml)處理CHO細胞24h后,MTT法檢測結(jié)果顯示隨著毒素濃度升高,細胞形態(tài)逐漸改變,細胞活性逐漸降低。且與對照組相比,5μg/ml、10μg/ml和15gg/ml染毒組差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。集落形成實驗中隨著染毒濃度增加,集落形成能力下降,與上述結(jié)果一致,也證明MC-LR能抑制CHO細胞活性。 2.本次研究發(fā)現(xiàn),MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)作用于CHO細胞24h后,各染毒組的細胞內(nèi)CAT水平降低,ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化升高。與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3. MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細胞24h后,用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測線粒體膜電位,結(jié)果顯示隨著毒素濃度升高,線粒體膜電位降低,存在劑量依賴關系。與對照組相比,各染毒組差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.隨著染毒濃度增大,細胞中caspase-3(?)(?)性劑量依賴性增強。且與對照組相比,各濃度MC-LR染毒組的差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),MC-LR(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml)處理CHO細胞24h后,各染毒組細胞凋亡率隨著毒素濃度的升高而升高,且差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論： 1.暴露于MC-LR能誘導體外培養(yǎng)的CHO細胞發(fā)生氧化應激。 2.誘導氧化損傷后,MC-LR導致進一步的毒性作用,抑制CHO細胞活性,并可能通過線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡,對雌鼠具有生殖毒性作用。
[Abstract]:Microcystins (Microcystins, MCs) is produced by cyanobacteria, a single ring of 7 peptide biological toxins, has found 80 kinds of isomers, the most common one, in-depth study is of microcystin -LR (MC-LR). MCs can enter the body through the food chain and water, a serious threat to human life and health.
The gonad is second target organ of MCs, studies have proved that MCs has reproductive toxicity. However, researches on the MCs induced reproductive system especially in female reproductive system. The data is more, its toxic mechanism is uncertain. But studies have found that MC-LR can exist in the egg and transmitted to the offspring, but also has environmental endocrine disrupting effects of MC-LR, can exert estrogenic effects on fish and mammalian cells. It has important significance to study the toxic effects of MC-LR on female reproductive system.
In this study, Chinese hamster ovary (CHO) cells as a model, after exposure to MC-LR, to detect the changes of the activity of CHO cells, and the intracellular reactive oxygen species, antioxidant enzymes, lipid peroxidation, mitochondrial membrane potential, aspartate specific cysteine protease -3 (Caspase-3) activity and apoptosis rate, to investigate the toxicity effect of MC-LR on CHO cells at the molecular level and provide a theoretical basis for the reproductive toxicity of MC-LR is clarified.
Method錛，

本文編號：1414005