本文關(guān)鍵詞：SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)pH值降低對(duì)早老素-1表達(dá)的影響　出處：《遼寧醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 阿爾茨海默病 γ-分泌酶 早老素-1 細(xì)胞內(nèi)pH值

【摘要】：目的 本文旨在研究當(dāng)細(xì)胞內(nèi)pH值降低時(shí)早老素-1的表達(dá)變化情況，從而探討細(xì)胞內(nèi)pH值變化與γ-分泌酶活性的關(guān)系。 方法 SH-SY5Y細(xì)胞于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，其中一部分細(xì)胞利用腺病毒干擾質(zhì)粒pAd-miR-NHE1和腺病毒空載體pAd-miR-NC，按照最佳MOI值感染SH-SY5Y細(xì)胞，抑制NHE1基因表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)pH值降低，構(gòu)建細(xì)胞內(nèi)酸化模型和空載體轉(zhuǎn)染組。另一部分細(xì)胞用酸化培養(yǎng)基培養(yǎng)，以pH值6.8為基準(zhǔn)，依次降低0.5形成6個(gè)梯度pH值的培養(yǎng)基，通過(guò)計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線確定最適細(xì)胞生長(zhǎng)的酸性培養(yǎng)基，通過(guò)降低細(xì)胞外環(huán)境酸堿度，激活酸敏感離子通道，降低細(xì)胞內(nèi)pH值，構(gòu)建酸化培養(yǎng)基組。實(shí)驗(yàn)以四組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)，包括正常細(xì)胞組、陰性對(duì)照組（空載體轉(zhuǎn)染組）、NHE1基因抑制組和酸化培養(yǎng)基組。應(yīng)用熒光指示劑BCECF/AM，熒光分光光度計(jì)記錄490nm/440nm熒光強(qiáng)度比值，制備pHi標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出各組細(xì)胞內(nèi)pH值。ELISA法定量分析各組細(xì)胞內(nèi)早老素-1的活性，Real-Time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)早老素-1的mRNA表達(dá)，Western Blotting檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)早老素-1蛋白表達(dá)，，分析細(xì)胞內(nèi)pH值變化對(duì)早老素-1表達(dá)和活性的影響及其與γ-分泌酶的關(guān)系。 結(jié)果 靶向人NHE1mRNA的腺病毒干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，抑制了NHE1表達(dá)。正常細(xì)胞在不同pH值的培養(yǎng)基培養(yǎng)72小時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)曲線分析選出最適細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基pH值為6.3。應(yīng)用熒光分光光度計(jì)，根據(jù)pHi標(biāo)準(zhǔn)曲線求出NHE1抑制組和酸化培養(yǎng)基組的細(xì)胞內(nèi)pH值分別為6.62±0.02和6.99±0.02，較正常細(xì)胞組（pHi=7.27±0.02）和陰性對(duì)照組（pHi=7.24±0.03）降低，差別有顯著性意義（P0.05），而正常細(xì)胞組和陰性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)pH值無(wú)明顯變化，差異無(wú)顯著性意義（P0.05），說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)酸化的SH-SY5Y細(xì)胞模型成功建立。ELISA法定量分析各組細(xì)胞內(nèi)早老素-1的活性，NHE1抑制組和酸化培養(yǎng)基組的細(xì)胞內(nèi)早老素-1水平分別為26.3±4.2ng/L和23.5±4.0ng/L，較正常細(xì)胞組（9.1±0.6ng/L）和陰性對(duì)照組（7.8±1.1ng/L）明顯增多，有顯著性差異（P0.05）。Real-Time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)早老素-1的mRNA表達(dá)，NHE1抑制組和酸化培養(yǎng)基組細(xì)胞內(nèi)的早老素-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.75±0.04和1.39±0.03，較正常細(xì)胞組（1.23±0.01）和陰性對(duì)照組（1.00）有顯著提高（P0.05）。Western Blotting檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)早老素-1蛋白表達(dá)，NHE1抑制組和酸化培養(yǎng)基組細(xì)胞內(nèi)的PS1蛋白表達(dá)分別為0.70±0.01和0.68±0.08，較正常細(xì)胞組（0.54±0.01）和陰性對(duì)照組（0.55±0.05）有顯著差異（P0.05），而NHE1抑制組和酸化培養(yǎng)基組組間比較無(wú)明顯差異（P0.05），正常細(xì)胞組和負(fù)對(duì)照組組間比較也無(wú)明顯差異（P0.05）。 結(jié)論 細(xì)胞內(nèi)pH值降低可促使早老素-1表達(dá)量增加，活性增高。目前認(rèn)為早老素-1是γ-分泌酶的主要成分和活性中心，因此推測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH值降低可使γ-分泌酶活性增高，從而導(dǎo)致Aβ生成增多。
[Abstract]:Purpose The purpose of this study was to study the changes of the expression of presenin-1 when the intracellular pH value was decreased, and to explore the relationship between the change of intracellular pH value and the activity of 緯-secretase. Method SH-SY5Y cells were cultured in incubator. Some of the cells were treated with adenovirus interference plasmid pAd-miR-NHE1 and adenovirus empty vector pAd-miR-NC. According to the best MOI value, SH-SY5Y cells were infected, NHE1 gene expression was inhibited, and the intracellular pH value was decreased. The intracellular acidification model and empty vector transfection group were constructed. The other part of the cells were cultured in acidified medium. The other part of the cells were cultured on the basis of pH 6.8 and reduced 0.5 to form 6 gradient pH medium in turn. The growth curve was plotted to determine the most suitable acid medium for cell growth. The pH value of the cells was reduced by reducing the pH value of the cells and activating the acid-sensitive ion channels. Four groups of cells were tested, including normal cells group and negative control group (empty vector transfection group). NHE1 gene inhibition group and acidizing medium group. Fluorescence indicator BCECF / AM and fluorescence spectrophotometer were used to record the fluorescence intensity ratio of 490 nm / 440 nm to prepare the pHi standard curve. The intracellular pH value of each group was calculated. Elisa method was used to quantitatively analyze the activity of intracellular presenin 1 in each group. Real-Time PCR was used to detect the expression of mRNA in the cells of each group. Western. The expression of presenin-1 protein was detected by Blotting. The effect of intracellular pH on the expression and activity of presenin-1 and its relationship with 緯-secretase were analyzed. Results The adenovirus interference plasmid targeting human NHE1mRNA was transfected into SH-SY5Y cells and inhibited the expression of NHE1. The normal cells were cultured in different pH medium for 72 hours. According to the analysis of cell growth state and growth curve, the optimum cell growth medium pH value was 6.3. The fluorescence spectrophotometer was used. According to the pHi standard curve, the intracellular pH values of NHE1 inhibition group and acidified medium group were 6.62 鹵0.02 and 6.99 鹵0.02, respectively. Compared with normal cell group (7.27 鹵0.02) and negative control group (7.24 鹵0.03), the difference was significant (P 0.05). However, there was no significant difference in intracellular pH between normal cell group and negative control group (P 0.05). The results showed that the SH-SY5Y cell model of intracellular acidification was successfully established. Elisa was used to quantitatively analyze the activity of intracellular presenin-1 in each group. The intracellular presenin 1 levels in NHE1 inhibition group and acidified medium group were 26.3 鹵4.2 ng / L and 23.5 鹵4.0 ng / L, respectively. Compared with normal cell group (9.1 鹵0.6 ng / L) and negative control group (7.8 鹵1.1 ng / L). There was a significant difference in the expression of mRNA of presenin 1 in the cells of each group by P0.05An. Real-Time PCR. The relative expression of mRNA in the cells of NHE1 inhibition group and acidified medium group was 1.75 鹵0.04 and 1.39 鹵0.03, respectively. Compared with normal cell group (1.23 鹵0.01) and negative control group (1.00), it was significantly higher than that of normal cell group (1.23 鹵0.01) and negative control group (1.00). Western Blotting was used to detect the expression of presenin 1 protein in the cells of each group. The expression of PS1 protein was 0.70 鹵0.01in NHE1 inhibition group and 0.68 鹵0.08 in acidified medium group, respectively. There was significant difference between normal cell group (0.54 鹵0.01) and negative control group (0.55 鹵0.05) (P 0.05). There was no significant difference between NHE1 inhibition group and acidified medium group, and there was no significant difference between normal cell group and negative control group. Conclusion The decrease of intracellular pH value can increase the expression and activity of presenin-1, which is considered to be the main component and active center of 緯-secretory enzyme. It is suggested that the decrease of intracellular pH value can increase the activity of 緯 -secretory enzymes, which leads to the increase of A 尾 production.
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：1413537