本文關(guān)鍵詞：共刺激分子增強(qiáng)雙功能抗體介導(dǎo)的T細(xì)胞殺傷　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景與目的T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞,其活化程度直接影響抗腫瘤治療效果。調(diào)控T細(xì)胞增殖成為效應(yīng)細(xì)胞需要抗原肽-MHC分子復(fù)合物介導(dǎo)的特異性刺激信號和B7、4-1BBL等分子提供的共刺激信號。如果在增殖分化過程中未能獲得共刺激信號,T細(xì)胞可能會出現(xiàn)活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(activation-induced cell death, AICD)或者無能狀態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致抗腫瘤免疫功能低下。而通過低表達(dá)共刺激分子降低免疫原性,使得識別它的抗原提呈細(xì)胞或淋巴細(xì)胞得不到充分的活化信號,是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要機(jī)制之一。本課題通過克隆人4-1BBL胞膜外區(qū)及構(gòu)建4-1BBL/anti-CD20融合蛋白來激活T細(xì)胞表面4-1BB信號通路、通過聯(lián)合應(yīng)用阿糖胞苷提高靶細(xì)胞表面B7分子的表達(dá)水平達(dá)到提高共刺激信號的目的,以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的活化,增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng),更好地抑制腫瘤甚至徹底清除腫瘤。 方法與結(jié)果 第一部分實(shí)驗(yàn)中,體外用CytoTox96Nonradioactived Assay kit檢測了4-1BBL胞膜外區(qū)蛋白聯(lián)合anti-CD3/anti-Pgp微型雙特異抗體對靶向的K562/A02細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,用Calcein-AM法檢測了4-1BBL胞膜外區(qū)蛋白及4-1BBL/anti-CD20融合蛋白聯(lián)合anti-CD3/anti-CD20微型雙特異抗體對靶向的Raji細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,證明增強(qiáng)4-1BBL信號確實(shí)能夠提高T細(xì)胞殺傷效果,而具有CD20和4-1BBL雙靶向的融合蛋白激活信號能力較單一的4-1BBL分子更為理想,聯(lián)合殺傷效果更為突出。在體內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用4-1BBL胞膜外區(qū)蛋白和anti-CD3/anti-Pgp治療裸鼠K562/A02移植瘤,聯(lián)合應(yīng)用4-1BBL/anti-CD20和anti-CD3/anti-CD20治療裸鼠Raji移植瘤,顯著控制了腫瘤的生長并清除腫瘤,觀察至100天未見腫瘤復(fù)發(fā)。 第二部分實(shí)驗(yàn)中,取不同終濃度的抗代謝類化療藥阿糖胞苷(Ara-C),作用靶細(xì)胞72h,FACS測定B7分子(CD80和CD86)表達(dá)。取不同終濃度Ara-C作用靶細(xì)胞72h,MTT法檢測Ara-C對靶細(xì)胞的抑制率。確定使靶細(xì)胞CD80和CD86表達(dá)升高但又不產(chǎn)生抑制效果的Ara-C終濃度0.251μmol/l。Calcein-AM法測定雙功能抗體聯(lián)合Ara-C的體外殺傷活性,殺傷效果比未經(jīng)Ara-C處理的效果明顯(p0.05)。體內(nèi)采用K562/A02細(xì)胞移植瘤模型,聯(lián)合阿糖胞苷和anti-CD3/anti-PGP Diabody治療,效果優(yōu)于雙功能抗體單用,并且對防止腫瘤二次復(fù)發(fā)有很好效果。 結(jié)論4-1BBL、4-1BBL/anti-CD20和anti-CD3/anti-Pgp、anti-CD3/anti-CD20聯(lián)合使用體內(nèi)外均有效激活T細(xì)胞,增強(qiáng)其殺傷作用。非抑制劑量化療藥阿糖胞苷使靶細(xì)胞CD80表達(dá)升高,再聯(lián)合雙功能抗體使體外介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的效果提高近20%。體內(nèi)K562/A02移植瘤模型也證實(shí)阿糖胞苷在雙功能抗體的治療中起到重要輔助作用,可以有效提升療效。以上結(jié)果均說明共刺激途徑的激活對于維持和提高T細(xì)胞殺傷能力是至關(guān)重要的。
[Abstract]:Background and objective T lymphocyte is the main effector cell immunity, its activation degree directly affect the anti tumor therapy effect. The proliferation of T cells into costmulatory signal effect cells require specific stimulation signal and B7,4-1BBL antigen -MHC molecular complex mediated offer. If failed in the proliferation and differentiation in the process of CO the stimulation signal, T cells may lead to activation induced cell death (activation-induced cell, death, AICD) or incompetent state, resulting in antitumor immunity. The low expression of costimulatory molecules to reduce immunogenicity, it makes the recognition of antigen presenting cells or lymphocytes are not fully activated signal is. One of the important mechanisms of tumor immune escape. The cloning of human 4-1BBL extracellular domain and construct 4-1BBL/anti-CD20 fusion protein to activate T cell surface 4 -1BB signaling pathway can enhance the expression level of B7 molecules on target cells by enhancing the expression level of target molecules on the surface of target cells, so as to enhance the activation of costimulatory signals, promote the activation of lymphocytes, enhance the anti-tumor immune response, and further inhibit the tumor and even completely remove the tumor.
Methods and results
The first part of the experiment, the in vitro detection of extracellular domain of human 4-1BBL and anti-CD3/anti-Pgp micro bispecific antibody targeting on the cytotoxicity of K562/A02 cells by CytoTox96Nonradioactived Assay kit, the extracellular domain of human 4-1BBL and 4-1BBL/ anti-CD20 fusion protein and anti-CD3/anti-CD20 Mini bispecific antibody targeting on the cytotoxicity of Raji cells detected by Calcein-AM method that enhanced 4-1BBL signal can indeed improve the killing effect of T cells, with CD20 and 4-1BBL dual targeting fusion protein activation signal ability than a single 4-1BBL molecule is more ideal, and the killing effect is more outstanding. In the combined application of in vivo extracellular domain of human 4-1BBL and anti-CD3/anti-Pgp treatment of K562/A02 xenografts in nude mice. The combined application of 4-1BBL/anti-CD20 and anti-CD3/anti-CD20 treatment of Raji xenografts in nude mice, significantly control tumor growth The tumor was removed and no recurrence of the tumor was observed for 100 days.
The second part of the experiment, cytarabine from different concentrations of anti metabolism drugs (Ara-C), the target cell 72h, FACS of B7 molecules (CD80 and CD86). The expression of different concentrations of Ara-C target cells 72h, inhibition of target cell detection rate of Ara-C MTT method. To determine the target cells of CD80 and the expression of CD86 increased but does not produce the inhibitory effect of Ara-C determination of cytotoxicity of bispecific antibody combined with Ara-C in vitro at concentration of 0.251 mol/l.Calcein-AM, the killing effect than the untreated Ara-C (P0.05). The effect is obvious in vivo by using K562/A02 cell xenograft model combined with cytarabine and anti-CD3/anti-PGP Diabody treatment is better than the double function antibody alone, and to prevent the tumor recurred two times has a very good effect.
Conclusion 4-1BBL, 4-1BBL/anti-CD20 and anti-CD3/anti-Pgp, anti-CD3/anti-CD20 combined with in vitro and in vivo effectively activate T cells and enhance its cytotoxic effect. Non inhibitor chemotherapy cytarabine target cells increase the expression of CD80, and combined with the bifunctional antibody in vitro mediated T cell target cell killing effect increased by nearly 20%. in K562/A02 transplanted tumor model also confirmed Ara plays an important role in the treatment of auxiliary bifunctional antibody, can effectively improve the curative effect. The above results suggest that the activation of costimulatory pathway is crucial for maintaining and improving the ability of T cells.

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

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本文編號：1413455