本文關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-3在血管新生與淋巴管新生中的不同機(jī)制研究　出處：《南京大學(xué)》2011年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：胚胎發(fā)育早期的血管形成主要分為兩步：管腔生成與血管新生。管腔生成是指卵黃膜上血島外的血管內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞增殖分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞并相互匯聚形成初級(jí)血管網(wǎng),血管新生則是指初級(jí)血管網(wǎng)經(jīng)過(guò)重塑形成成熟的具有不同結(jié)構(gòu)的血管網(wǎng)絡(luò)的過(guò)程。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-3 (VEGFR-3)屬于受體酪氨酸激酶(RTK),在該時(shí)期高度表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGFR-3在血管新生過(guò)程中起重要作用,VEGFR-3基因敲除嚴(yán)重影響早期的血管新生與造血形成過(guò)程,小鼠死于胚胎期9.5-10.5天。淋巴管的發(fā)育晚于血管的發(fā)育,開(kāi)始于胚胎期10.5天。這時(shí),主靜脈管腔中一側(cè)的血管內(nèi)皮細(xì)胞分化成淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞并高表達(dá)VEGFR-3。在VEGFR-3配體,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子-C (VEGF-C)的誘導(dǎo)下淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移出主靜脈,形成與主靜脈分離的淋巴囊OVEGF-C與VEGF-D是目前已知的VEGFR-3的配體,但是VEGF-C與VEGF-D基因雙敲除的小鼠只有淋巴管發(fā)育缺陷,血管發(fā)育不受影響,與VEGFR-3基因敲除小鼠的表型不同。這個(gè)結(jié)果顯示VEGFR-3可能存在除VEGF-C/D以外的其他配體,也有可能VEGFR-3在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用與配體結(jié)合沒(méi)有關(guān)系。抑制腫瘤血管新生與病理狀態(tài)下的視網(wǎng)膜血管新生已成為眾多藥物的靶點(diǎn),新生血管被發(fā)現(xiàn)表達(dá)高量的VEGFR-3,使用VEGFR-3抗體可提高VEGFR-2抗血管新生作用,更多的VEGFR-3抗體目前正在緊張研制中,用于與VEGF抗體(如Avastin(?))的聯(lián)合治療。所以,我們認(rèn)為區(qū)分VEGFR-3在血管與淋巴管發(fā)育中的不同功能,找出VEGFR-3在血管新生中的作用機(jī)制將有助于我們更好的理解VEGFR-3,開(kāi)發(fā)針對(duì)VEGFR-3的新藥。在本研究中,我們首先建立了VEGFR-3包外配體結(jié)合區(qū)條件性基因敲除小鼠模型(Vegfr3△LBD)。同時(shí)我們也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)失去配體結(jié)合區(qū)域的VEGFR-3不能結(jié)合VEGF-C。理論上講,即便存在不為人知的VEGF-C/D以外的VEGFR-3的配體也無(wú)法與VEGFR-3結(jié)合。在獲得純合子小鼠后(Vegfr3△LBD/△LBD),我們?cè)趍RNA與蛋白水平上對(duì)VEGFR-3進(jìn)行了檢測(cè),驗(yàn)證了VEGFR-3△LBD的表達(dá)。Vegfr3△LBDI/△LBD小鼠表現(xiàn)出較明顯的淋巴管發(fā)育缺陷,僅能形成淋巴囊,且發(fā)育遲緩,形態(tài)簡(jiǎn)單,除此以外其他各器官均無(wú)淋巴管形成。原始淋巴囊的形成證明還有微弱的VEGFR-3信號(hào)存在,這個(gè)信號(hào)可能由VEGF-C的另一個(gè)受體神經(jīng)纖毛蛋白-2(Nuropilin-2)或別的因子所介導(dǎo),詳細(xì)的機(jī)制仍有待研究。無(wú)論是在胚胎期10.5天還是胚胎期15.5天,Vegfr3△LBD/△LBD小鼠卵黃膜與胚胎的血管發(fā)育均正常,小鼠因淋巴管缺失造成全身積水而死于出生前。該結(jié)果提示既然VEGFR-3△LBD可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞上行使正常功能,則體內(nèi)存在VEGF-C/D以外的配體的可能性很小。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的假設(shè),我們引入了另一個(gè)基因突變小鼠模型-Vegfr3TKmut。該小鼠為ENU突變篩選所得, VEGFR-3蛋白序列中1053位異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼岫TP結(jié)合能力,造成胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)功能喪失。由于VEGFR-3TKmut胞外區(qū)無(wú)突變,所以可以與野生型VEGFR-3形成二聚體并體現(xiàn)出顯性抑制效應(yīng)。Vegfr3+/-小鼠發(fā)育正常而Vegfr3+/TKmut小鼠則出現(xiàn)腹水表型,腸道淋巴管發(fā)育異常而皮膚則少有淋巴管覆蓋。由于該突變的顯性抑制作用可降低VEGF-C/VEGFR-3的信號(hào)水平,我們檢查了Vegfr3+/TKmut小鼠胚胎期,出生后視網(wǎng)膜以及腫瘤的血管新生,我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比均無(wú)明顯變化。為了進(jìn)一步降低VEGFR-3的信號(hào),我們將Vegfr3+/TKmut小鼠交配并鑒定出Vegfr3TKmut/TKmut小鼠,發(fā)現(xiàn)該小鼠完全沒(méi)有淋巴管生長(zhǎng),也沒(méi)有淋巴囊形成。該小鼠同樣由于嚴(yán)重積水死于出生前后,但血管發(fā)育未受影響。上述VEGFR-3功能缺失的小鼠模型向我們展示盡管VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)通路對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞至關(guān)重要,而在血管內(nèi)皮細(xì)胞中則不起作用。VEGFR-3在胚胎期10.5天前高度表達(dá)于血管,它的存在是血管新生所必須的,而胚胎期10.5天后則主要表達(dá)于淋巴管,所以我們建立了VEGFR-3條件性轉(zhuǎn)基因小鼠,試圖使VEGFR-3可以持續(xù)的在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)。該轉(zhuǎn)基因小鼠采用了CAG啟動(dòng)子,在所有組織中均可表達(dá),在沒(méi)有Cre重組酶的情況下只表達(dá)熒光素酶,而在Cre重組酶存在的情況下則可以移除熒光素酶序列,起始VEGFR-3的表達(dá)。在將該轉(zhuǎn)基因小鼠與內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的小鼠(TEKCre)交配后,我們?cè)趦?nèi)皮細(xì)胞上檢測(cè)到了外源性VEGFR-3的高表達(dá),同時(shí)小鼠死于胚胎期11.5天并伴隨著嚴(yán)重的血管新生障礙與貧血表型。這個(gè)結(jié)果顯示雖然VEGFR-3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是不重要的,但是VEGFR-3的存在和適量表達(dá)是重要的,過(guò)多的VEGFR-3同樣會(huì)影響血管新生。為了能在細(xì)胞與分子水平上進(jìn)一步了解VEGFR-3在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用機(jī)制,我們引進(jìn)了表達(dá)Tsa58t(SV40)的轉(zhuǎn)基因小鼠,將用于分離表達(dá)各種VEGR-3基因改造小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞。由于小鼠原代血管內(nèi)皮細(xì)胞不易分離且難于培養(yǎng),我們同時(shí)構(gòu)建了VEGFR-3 WT,VEGFR-3 △LBD以及VEGFR-3TKmut的病毒載體,并在原代分離的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論哪種形式的VEGFR-3都可以與VEGFR-2結(jié)合,降低VEGF-A介導(dǎo)的VEGFR-2磷酸化水平以及下游分子Erkl/2的磷酸化水平�？傊�,我們通過(guò)基因改造小鼠模型證明VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)通路僅在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中起作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,VEGFR-3很可能與VEGFR-2形成異二聚體從而調(diào)控其下游的信號(hào)。
[Abstract]:Vascular endothelial cell growth factor receptor - 3 ( VEGFR - 3 ) plays an important role in angiogenesis . The expression of VEGFR - 3 , VEGFR - 3 , VEGFR - 3 and VEGFR - 3 in vascular endothelial cells was observed .

【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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