本文關鍵詞：血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-3在血管新生與淋巴管新生中的不同機制研究　出處：《南京大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：胚胎發(fā)育早期的血管形成主要分為兩步：管腔生成與血管新生。管腔生成是指卵黃膜上血島外的血管內(nèi)皮細胞祖細胞增殖分化成血管內(nèi)皮細胞并相互匯聚形成初級血管網(wǎng),血管新生則是指初級血管網(wǎng)經(jīng)過重塑形成成熟的具有不同結構的血管網(wǎng)絡的過程。血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-3 (VEGFR-3)屬于受體酪氨酸激酶(RTK),在該時期高度表達于血管內(nèi)皮細胞。VEGFR-3在血管新生過程中起重要作用,VEGFR-3基因敲除嚴重影響早期的血管新生與造血形成過程,小鼠死于胚胎期9.5-10.5天。淋巴管的發(fā)育晚于血管的發(fā)育,開始于胚胎期10.5天。這時,主靜脈管腔中一側的血管內(nèi)皮細胞分化成淋巴管內(nèi)皮細胞并高表達VEGFR-3。在VEGFR-3配體,血管內(nèi)皮細胞生長因子-C (VEGF-C)的誘導下淋巴管內(nèi)皮細胞遷移出主靜脈,形成與主靜脈分離的淋巴囊OVEGF-C與VEGF-D是目前已知的VEGFR-3的配體,但是VEGF-C與VEGF-D基因雙敲除的小鼠只有淋巴管發(fā)育缺陷,血管發(fā)育不受影響,與VEGFR-3基因敲除小鼠的表型不同。這個結果顯示VEGFR-3可能存在除VEGF-C/D以外的其他配體,也有可能VEGFR-3在血管內(nèi)皮細胞中的作用與配體結合沒有關系。抑制腫瘤血管新生與病理狀態(tài)下的視網(wǎng)膜血管新生已成為眾多藥物的靶點,新生血管被發(fā)現(xiàn)表達高量的VEGFR-3,使用VEGFR-3抗體可提高VEGFR-2抗血管新生作用,更多的VEGFR-3抗體目前正在緊張研制中,用于與VEGF抗體(如Avastin(?))的聯(lián)合治療。所以,我們認為區(qū)分VEGFR-3在血管與淋巴管發(fā)育中的不同功能,找出VEGFR-3在血管新生中的作用機制將有助于我們更好的理解VEGFR-3,開發(fā)針對VEGFR-3的新藥。在本研究中,我們首先建立了VEGFR-3包外配體結合區(qū)條件性基因敲除小鼠模型(Vegfr3△LBD)。同時我們也通過實驗證實失去配體結合區(qū)域的VEGFR-3不能結合VEGF-C。理論上講,即便存在不為人知的VEGF-C/D以外的VEGFR-3的配體也無法與VEGFR-3結合。在獲得純合子小鼠后(Vegfr3△LBD/△LBD),我們在mRNA與蛋白水平上對VEGFR-3進行了檢測,驗證了VEGFR-3△LBD的表達。Vegfr3△LBDI/△LBD小鼠表現(xiàn)出較明顯的淋巴管發(fā)育缺陷,僅能形成淋巴囊,且發(fā)育遲緩,形態(tài)簡單,除此以外其他各器官均無淋巴管形成。原始淋巴囊的形成證明還有微弱的VEGFR-3信號存在,這個信號可能由VEGF-C的另一個受體神經(jīng)纖毛蛋白-2(Nuropilin-2)或別的因子所介導,詳細的機制仍有待研究。無論是在胚胎期10.5天還是胚胎期15.5天,Vegfr3△LBD/△LBD小鼠卵黃膜與胚胎的血管發(fā)育均正常,小鼠因淋巴管缺失造成全身積水而死于出生前。該結果提示既然VEGFR-3△LBD可以在血管內(nèi)皮細胞上行使正常功能,則體內(nèi)存在VEGF-C/D以外的配體的可能性很小。為了進一步驗證我們的假設,我們引入了另一個基因突變小鼠模型-Vegfr3TKmut。該小鼠為ENU突變篩選所得, VEGFR-3蛋白序列中1053位異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼岫TP結合能力,造成胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)功能喪失。由于VEGFR-3TKmut胞外區(qū)無突變,所以可以與野生型VEGFR-3形成二聚體并體現(xiàn)出顯性抑制效應。Vegfr3+/-小鼠發(fā)育正常而Vegfr3+/TKmut小鼠則出現(xiàn)腹水表型,腸道淋巴管發(fā)育異常而皮膚則少有淋巴管覆蓋。由于該突變的顯性抑制作用可降低VEGF-C/VEGFR-3的信號水平,我們檢查了Vegfr3+/TKmut小鼠胚胎期,出生后視網(wǎng)膜以及腫瘤的血管新生,我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比均無明顯變化。為了進一步降低VEGFR-3的信號,我們將Vegfr3+/TKmut小鼠交配并鑒定出Vegfr3TKmut/TKmut小鼠,發(fā)現(xiàn)該小鼠完全沒有淋巴管生長,也沒有淋巴囊形成。該小鼠同樣由于嚴重積水死于出生前后,但血管發(fā)育未受影響。上述VEGFR-3功能缺失的小鼠模型向我們展示盡管VEGF-C/VEGFR-3信號通路對淋巴管內(nèi)皮細胞至關重要,而在血管內(nèi)皮細胞中則不起作用。VEGFR-3在胚胎期10.5天前高度表達于血管,它的存在是血管新生所必須的,而胚胎期10.5天后則主要表達于淋巴管,所以我們建立了VEGFR-3條件性轉基因小鼠,試圖使VEGFR-3可以持續(xù)的在血管內(nèi)皮細胞中高表達。該轉基因小鼠采用了CAG啟動子,在所有組織中均可表達,在沒有Cre重組酶的情況下只表達熒光素酶,而在Cre重組酶存在的情況下則可以移除熒光素酶序列,起始VEGFR-3的表達。在將該轉基因小鼠與內(nèi)皮細胞特異性表達Cre的小鼠(TEKCre)交配后,我們在內(nèi)皮細胞上檢測到了外源性VEGFR-3的高表達,同時小鼠死于胚胎期11.5天并伴隨著嚴重的血管新生障礙與貧血表型。這個結果顯示雖然VEGFR-3的信號轉導作用對血管內(nèi)皮細胞是不重要的,但是VEGFR-3的存在和適量表達是重要的,過多的VEGFR-3同樣會影響血管新生。為了能在細胞與分子水平上進一步了解VEGFR-3在血管內(nèi)皮細胞中的作用機制,我們引進了表達Tsa58t(SV40)的轉基因小鼠,將用于分離表達各種VEGR-3基因改造小鼠的血管內(nèi)皮細胞。由于小鼠原代血管內(nèi)皮細胞不易分離且難于培養(yǎng),我們同時構建了VEGFR-3 WT,VEGFR-3 △LBD以及VEGFR-3TKmut的病毒載體,并在原代分離的人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞中過表達。我們發(fā)現(xiàn)無論哪種形式的VEGFR-3都可以與VEGFR-2結合,降低VEGF-A介導的VEGFR-2磷酸化水平以及下游分子Erkl/2的磷酸化水平�？傊�,我們通過基因改造小鼠模型證明VEGF-C/VEGFR-3信號通路僅在淋巴管內(nèi)皮細胞中起作用。在血管內(nèi)皮細胞中,VEGFR-3很可能與VEGFR-2形成異二聚體從而調(diào)控其下游的信號。
[Abstract]:Vascular endothelial cell growth factor receptor - 3 ( VEGFR - 3 ) plays an important role in angiogenesis . The expression of VEGFR - 3 , VEGFR - 3 , VEGFR - 3 and VEGFR - 3 in vascular endothelial cells was observed .

【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

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