本文關(guān)鍵詞：氧濃度對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞成骨分化的影響　出處：《山東大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 蛻膜基質(zhì)細(xì)胞 誘導(dǎo)成骨 常氧 低氧

【摘要】：目的： 研究發(fā)現(xiàn),骨組織工程的種子細(xì)胞骨髓干細(xì)胞數(shù)量有限,取材及增殖分化困難,在臨床應(yīng)用中也受到病人經(jīng)濟條件的制約；而近期研究表明蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(Decidual Stromal Cells, DSC)可在一定條件下誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。本實驗通過體外分離培養(yǎng)人早孕蛻膜基質(zhì)細(xì)胞,并對其進(jìn)行體外培養(yǎng)、擴增；將部分蛻膜細(xì)胞向成骨細(xì)胞(Osteoblast, OB)方向誘導(dǎo)；觀察常氧、低氧條件下蛻膜細(xì)胞的增殖情況及體外成骨能力,探討氧對蛻膜細(xì)胞誘導(dǎo)成骨能力的影響。 方法： 取人工流產(chǎn)6-8周妊娠蛻膜組織,采用機械研磨法分離蛻膜,復(fù)合酶消化,傳代自然增殖法純化細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng)擴增。倒置顯微鏡觀察其大體形態(tài),當(dāng)細(xì)胞傳至第五代以后性狀較穩(wěn)定,所以采用第六代蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。將細(xì)胞消化后吹打均勻,分為四組種入6孔板中：(1)DSC常氧對照組(2)DSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組(3)DSC低氧對照組(4)DSC低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組。將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)液,每隔兩至三天換一次液,持續(xù)誘導(dǎo)28天,每7天用PNPP法檢測各組細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)活性的表達(dá),酶標(biāo)儀測定光密度值(OD值)及茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果： 1.機械研磨及復(fù)合酶消化結(jié)合傳代自然增殖法純化細(xì)胞,獲取高純度的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞,且保持了較好的細(xì)胞活性。 2.蛻膜基質(zhì)細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液的作用下,三天后明顯形成集落,細(xì)胞明顯變大,并呈明顯的多邊形、三角形、不規(guī)則形,細(xì)胞體積比加誘導(dǎo)液之前明顯增大,胞漿透明,內(nèi)含少量顆粒樣或條索樣高密度結(jié)構(gòu)(附圖1,2)；成骨誘導(dǎo)10天,細(xì)胞層疊生長,細(xì)胞密集,中央可見類似結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)(附圖3)。經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞增殖較為緩慢,10～14天細(xì)胞才達(dá)到90%融合；對照組加入了常規(guī)培養(yǎng)基(1640培養(yǎng)基+10%FBS),細(xì)胞體積較小,呈長梭形,偶見多邊形,細(xì)胞增殖較快,大約5-7天可達(dá)到90%的細(xì)胞融合。 3.酶標(biāo)儀檢測光密度值(OD值)、各組ALP活性表達(dá)顯示：DSC常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組的ALP活性表達(dá)明顯高于其他三組(P0.05):DSC低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組的ALP活性表達(dá)明顯高于兩個常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)組(P0.05); 4.四組樣本培養(yǎng)7天,14天,21天,28天后茜素紅染色,成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞密集區(qū)有礦化結(jié)節(jié)形成(附圖4),茜素紅染色呈橘紅色,常氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)比低氧成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)組明顯,其余兩組未見。 結(jié)論： 1.蛻膜基質(zhì)細(xì)胞在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞； 2.在其他誘導(dǎo)條件相同的情況下,與低氧誘導(dǎo)相比,常氧誘導(dǎo)更有利于蛻膜基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成骨。
[Abstract]:Objective: It is found that the number of bone marrow stem cells in bone tissue engineering is limited, and it is difficult to obtain materials and proliferate and differentiate, which is also restricted by the economic conditions of patients in clinical application. Recent studies have shown that decidua stromal cells are Decidual Stromal Cells. Human decidual stromal cells were isolated and cultured in vitro. Some decidual cells were induced to osteoblast (OB). To observe the proliferation of decidual cells under normoxic and hypoxic conditions and the ability of osteogenesis in vitro, and to explore the effect of oxygen on the osteogenesis of decidual cells. Methods: The decidua tissue of pregnancy during 6-8 weeks of induced abortion was isolated by mechanical grinding, digested by complex enzyme, purified by natural proliferation method, cultured and amplified in vitro. The gross morphology of decidua was observed by inverted microscope. When the cells were transferred to the fifth generation, the characters were stable, so 6th passage decidual stromal cells were used for osteogenic differentiation culture. After digestion, the cells were blown evenly. Four groups were seeded into 6-well plate. The control group was divided into two groups: normal oxygen group (n = 2), osteogenesis induction group (n = 3) and hypoxic control group (n = 4). DSC hypoxic osteogenic culture group. The medium was replaced by osteogenic medium. The expression of alkaline phosphatase (ALP) activity was detected by PNPP assay every 7 days. Optical density value (OD value) and alizarin red staining were used to observe the formation of mineralized nodules. Results: 1. High purity decidual stromal cells were obtained by mechanical grinding and complex enzyme digestion combined with natural proliferation method. 2. Decidual stromal cells in osteoblast induction fluid, three days after the formation of colonies, the cells became significantly larger, and showed an obvious polygon, triangle, irregular shape. The cell volume increased obviously before the addition of inducer and the cytoplasm was transparent with a small amount of granular or strip-like high-density structure (Fig. 1). After induction of osteogenesis for 10 days, the cells were stacked, and the cells were dense, with nodular structure in the center (Fig. 3). After induction, the proliferation of the cells was slower than that of the cells at the end of 10 ~ 14 days before the cells reached 90% fusion. The control group was added to the conventional culture medium No. 1640. The cells were small, fusiform, occasionally polygonal, and the cells proliferated rapidly, and about 90% cells could be fused in 5-7 days. 3. The optical density value and OD value were detected by enzyme labeling instrument. The expression of ALP activity in each group was significantly higher than that in the other three groups (P 0.05). The expression of ALP activity in the osteogenic induction group was significantly higher than that in the two conventional culture medium groups. 4. Alizarin red staining was observed on the 7th day, 14th day, 21 day and 28 day after culture in the four groups. Mineralized nodules were formed in the dense areas of osteoblasts in the osteoblast induction group (Fig. 4, alizarin red staining was orange). Normogenic osteoblast induction culture was more obvious than hypoxia osteoblast induction culture group, but the other two groups were not seen. Conclusion: 1. Decidual stromal cells can be induced to differentiate into osteoblasts under certain conditions. 2. Under the same conditions, normoxic induction is more beneficial to osteogenesis of decidual stromal cells than hypoxia.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：1412249