本文關(guān)鍵詞：豬膀胱平滑肌細(xì)胞和移行上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及支架復(fù)合物的構(gòu)建　出處：《昆明醫(yī)學(xué)院》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分：豬膀胱平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 [目的]通過探索豬膀胱平滑肌細(xì)胞的取材、體外分離、原代培養(yǎng)、擴(kuò)增、及鑒定的方法,為其作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程膀胱提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法]采用滇南小耳豬,無菌條件下外科手術(shù)切取膀胱組織,仔細(xì)機(jī)械分離膀胱平滑肌層,采用胰蛋白酶和膠原酶Ⅰ聯(lián)合消化獲取膀胱平滑肌細(xì)胞,并以含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),觀察細(xì)胞形態(tài)變化,生長(zhǎng)及增殖過程,用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,并通過H-E染色、免疫組織化學(xué)染色、透射電鏡鑒定細(xì)胞。 [結(jié)果]體外培養(yǎng)的細(xì)胞可融合成片,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞為長(zhǎng)梭形,并表現(xiàn)出典型的“谷和峰”形態(tài),生長(zhǎng)曲線測(cè)定提示細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好、具有較強(qiáng)增殖能力。通過蘇木素—伊紅染色符合平滑肌細(xì)胞形態(tài)特征,平滑肌肌動(dòng)蛋白染色呈陽性,透射電鏡觀察符合肌細(xì)胞特征。 [結(jié)論]運(yùn)用該方法能夠簡(jiǎn)單易行地在體外培養(yǎng)出大量高純度的豬膀胱平滑肌細(xì)胞并建立了穩(wěn)定的培養(yǎng)體系；所培養(yǎng)出來的膀胱平滑肌細(xì)胞純度高、活力好可作為構(gòu)建組織工程膀胱的種子細(xì)胞。 第二部分：豬膀胱移行上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 [目的]通過探索豬膀胱移行上皮細(xì)胞的體外分離、原代培養(yǎng)、擴(kuò)增、及鑒定的方法,為其作為重要的種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程膀胱和尿路上皮組織提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法]采用滇南小耳豬,無菌條件下外科手術(shù)切取膀胱組織,置于中性蛋白酶中4℃冷消化過夜,仔細(xì)剝離得到粘膜組織,低濃度胰酶消化獲取高純度的膀胱移性上皮細(xì)胞,并以DK-SFM(含表皮生長(zhǎng)因子,胰島素)培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察細(xì)胞形態(tài)變化,生長(zhǎng)及增殖過程,并通過MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,蘇木素-伊紅染色,免疫組織化學(xué)染色,透射電鏡鑒定細(xì)胞。 [結(jié)果]用該方法消化可以從較少的組織中,獲得大量純度高、活力好的膀胱移性上皮細(xì)胞,原代培養(yǎng)的細(xì)胞16h后大量貼壁并發(fā)生形態(tài)改變,通過4-5天培養(yǎng)原代細(xì)胞能融合至80%-90%,表現(xiàn)出典型的“鋪路石”樣結(jié)構(gòu),傳代后細(xì)胞能夠穩(wěn)定生長(zhǎng),顯微鏡下未見雜細(xì)胞污染,經(jīng)過傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)加速約3-4天即可傳代,細(xì)胞6代以前形態(tài)規(guī)整,H-E染色、透射電鏡觀察符合上皮細(xì)胞特征,免疫組織化學(xué)染色呈陽性。 [結(jié)論]通過中性蛋白酶過夜冷消化和低濃度胰酶熱消化聯(lián)合應(yīng)用,經(jīng)過原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng),可獲得大量純度高、活力好的移行上皮細(xì)胞并建立了穩(wěn)定的上皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系,為其作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程膀胱和組織工程尿路上皮提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第三部分：豬膀胱平滑肌細(xì)胞和移行上皮細(xì)胞與SIS復(fù)合物的構(gòu)建 [目的]觀察膀胱平滑肌細(xì)胞和移行上皮細(xì)胞及兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)在脫細(xì)胞小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)上的生長(zhǎng)狀況,為組織工程膀胱種子細(xì)胞和支架材料的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法]將豬膀胱平滑肌細(xì)胞和移行上皮細(xì)胞分別接種到SIS支架材料上復(fù)合培養(yǎng),以及將兩種細(xì)胞按不同面接種于SIS上復(fù)合培養(yǎng),一周及10天取出細(xì)胞-SIS復(fù)合物,4%甲醛固定行石蠟切片H-E染色和掃描電鏡觀察膀胱平滑肌細(xì)胞和移行上皮細(xì)胞在SIS上的生長(zhǎng)狀況,以及兩種細(xì)胞混合培養(yǎng)在SIS上的生長(zhǎng)情況。 [結(jié)果]石蠟切片H-E染色,掃描電鏡觀察到SIS有很好的纖維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu),膀胱平滑肌細(xì)胞和移行上皮細(xì)胞能在SIS上粘附生長(zhǎng)、形態(tài)良好,混合培養(yǎng)的細(xì)胞能在SIS的兩個(gè)面上有序生長(zhǎng)且觀察到有部分細(xì)胞融合生長(zhǎng)。 [結(jié)論]膀胱平滑肌細(xì)胞和移行上皮細(xì)胞能在SIS上粘附生長(zhǎng)且細(xì)胞形態(tài)規(guī)整、活力好；SIS能夠?yàn)榘螂灼交〖?xì)胞和移行上皮細(xì)胞的附著、生長(zhǎng)以及新陳代謝提供三維空間,是構(gòu)建組織工程膀胱較為合適的支架材料。
[Abstract]:Part I : Primary Culture and Identification of Porcine Bladder Smooth Muscle Cells Objective : To explore the method of isolating , primary culture , amplification and identification of porcine bladder smooth muscle cells , which provide experimental basis for the construction of tissue engineering bladder as seed cells . Methods Bladder smooth muscle cells were surgically removed under aseptic conditions . Bladder smooth muscle cells were carefully separated by trypsin and collagenase 鈪，

本文編號(hào)：1411180