本文關鍵詞：MicroRNA-26對大鼠心臟重構的調控作用　出處：《廣州醫(yī)學院》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：【背景】 心臟重構(cardiac remodeling)是心臟在受到損傷或血液動力學改變等應激反應時,由于基因表達和蛋白調控的失常,導致心臟的結構和功能發(fā)生變化的病理過程。持續(xù)的心臟重構最終將導致心力衰竭(心衰,heart failure),并且是臨床患者心律失常和猝死的重要原因。目前逆轉心臟重構的手段仍較缺乏,之前的研究主要集中在心臟重構發(fā)病的神經體液和信號轉導通路的翻譯后調控,對于轉錄后調控的機制研究較少。微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長度約19~25 nt的單鏈非編碼RNA分子,通過與靶基因的結合,抑制或降解靶基因的mRNA,實現轉錄后水平的負調控。研究表明,在心臟重構過程中,許多miRNA的表達水平發(fā)生改變。其中,miRNA的表達譜芯片的結果顯示,miR-26在心臟重構動物模型心肌組織中的表達下調,因此,我們假設:通過功能獲得和缺失(gain-and loss-of-function)實驗,在心臟細胞中上調或下調miR-26的表達,可能會引起心臟細胞的表型發(fā)生變化;另外,結合生物信息學軟件的預測,GSK3β很可能是miR-26的靶基因之一,而GSK3β是心臟重構/心衰發(fā)病過程中的重要信號轉導通路,miR-26可能會通過調控GSK3β的表達,進而影響心臟重構。為此,我們通過建立心臟重構大鼠動物模型和細胞模型,首先明確miR-26在心臟重構中的表達特征,進而通過體外實驗,闡明miR-26的表達變化對心臟肥大和纖維化的影響,并驗證miR-26是否以GSK3β為靶點,為進一步闡明心臟重構/心衰的發(fā)病機制和尋找新的治療靶向提供實驗依據。 一、研究目的 1.闡明miR-26在大鼠心臟重構動物模型和細胞模型中的角色; 2.通過細胞實驗,明確miR-26、GSK3β和心臟重構三者之間的關系。 二、研究方法 1.腹主動脈縮窄法(transverse abdominal aortic constriction,TAAC)建立大鼠壓力過負荷心臟重構模型,用動物心臟彩超、QPCR和western blot檢測、病理組織切片染色等方法證實壓力過負荷心臟重構模型建立成功。 2. QPCR法檢測TAAC大鼠心肌組織和血漿miR-26的表達水平。 3.體外分離培養(yǎng)新生SD大鼠原代心肌細胞(CM)和心臟成纖維細胞(CF),QPCR法檢測正常培養(yǎng)和AngiotensinⅡ刺激后,CM和CF miR-26的表達水平。 4. CM和CF轉染miR-26 mimics和inhibitor后,QPCR法檢測miR-26的表達變化。 5. CM和CF先轉染miR-26 mimics再用AngiotensinⅡ誘導,或CM和CF單獨轉染miR-26 inhibitor,QPCR和western blot法檢測CM肥大基因、CF膠原mRNA和protein的變化,氚標亮氨酸摻入法檢測CM蛋白合成速率,免疫細胞化學法檢測CM細胞形態(tài)學變化。 6.對于TAAC大鼠心肌組織、AngiotensinⅡ刺激后的CM和CF ,用QPCR和western blot法檢測GSK3β表達量和活性的變化,以及磷酸化水平的改變。 7.對于轉染miR-26 mimics和inhibitor后的CM和CF,用QPCR和western blot法檢測GSK3β表達量和活性的變化,以及磷酸化水平的改變。 8.雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-26的靶基因GSK3β。 9.對于CM和CF,轉染GSK3β的小分子干擾RNA(siRNA),然后用AngiotensinⅡ刺激細胞,檢測GSK3β表達量和活性的變化,以及對CM肥大和CF膠原纖維合成的影響。 10.對于CM和CF,轉染GSK3β過表達質粒,檢測GSK3β表達量和活性的變化,以及對CM肥大和CF膠原纖維合成的影響。 三、結果 1.用TAAC法成功建立大鼠壓力過負荷心臟重構模型。 2. TAAC心臟重構大鼠的心肌組織和血漿中miR-26a和miR-26b的水平均較對照組(Sham)下調(P㩳0.05)。 3.用AngiotensinⅡ刺激后,CM和CF細胞中miR-26a和miR-26b的水平均較對照組下調(P㩳0.05)。 4. MiR-26在正常培養(yǎng)的CM中的表達水平明顯比在CF中高(P㩳0.05)。 5. CM和CF轉染miR-26 mimics后,miR-26a和miR-26b的表達量升高明顯(P㩳0.01);CM和CF轉染miR-26的inhibitor后,miR-26a和miR-26b的表達量下降(P㩳0.05)。 6.用AngiotensinⅡ刺激轉染miR-26 mimics后的CM和CF,肥大基因和膠原表達減少(P㩳0.05),蛋白合成速率減慢(P㩳0.05),細胞表面積縮小(P㩳0.05)。 7. CM和CF轉染miR-26 inhibitor后,肥大基因和膠原表達增加(P㩳0.05),P-tau蛋白表達量增加,骨架蛋白α-actin表達增加,蛋白合成速率加快(P㩳0.01),細胞表面積增大(P㩳0.01)。 8. TAAC心臟重構大鼠心肌組織GSK3βmRNA和protein的表達量均增加(P㩳0.05),且伴隨GSK3β的活性增強。 9.用AngiotensinⅡ刺激后,CM和CF的GSK3βmRNA表達量均增加(P㩳0.05)。 10. CM和CF轉染miR-26 mimics后,GSK3βmRNA和protein的表達量減少(P㩳0.05),而轉染miR-26 inhibitor后,GSK3βmRNA和protein的表達量增加(P㩳0.05)。 11.轉染miR-26 mimics,能抑制293T細胞中GSK3β3’UTR報告基因載體熒光素酶的表達,使其熒光素酶活性下降(P㩳0.01);轉染miR-26 inhibitor,能增加CM和CF細胞中GSK3β3’UTR報告基因載體熒光素酶的表達,使其熒光素酶活性增強(P㩳0.05);證實GSK3β是miR-26的靶基因。 12.用AngiotensinⅡ刺激轉染siGSK3β后的CM和CF,肥大基因或COL3的表達量下降(P㩳0.05)。 13. CM和CF轉染GSK3β過表達載體后, GSK3βmRNA和protein的表達量增加(P㩳0.05),且GSK3β的活性也增加,伴隨肥大基因和膠原的表達量增加。 四、結論 1. miR-26在大鼠心臟重構模型中表達下調。 2. miR-26可以通過抑制其靶點GSK3β調控心臟重構過程。
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【學位授予單位】：廣州醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【引證文獻】

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1 吳偉偉;宮平;哈尼克孜;石曉雷;于麗娟;田月珍;田可川;;動物胚胎發(fā)育中的MicroRNAs研究進展[J];草食家畜;2014年01期

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本文編號：1407973