本文關(guān)鍵詞：一種基于LVPC與VNTR的副溶血性弧菌基因分型新方法　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：副溶血性弧菌是革蘭氏陰性的嗜鹽弧菌,廣泛分布于港口、海水沿岸、海河交界處等,通過污染的海產(chǎn)品引起人類急性胃腸炎及旅行者性腹瀉。其主要毒力因子包括耐熱性直接溶血素(TDH)、與TDH相關(guān)溶血素(TRH)、不耐熱溶血素(TLH)和Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)。這些毒力因子大多數(shù)具有細胞毒性和(或)腸毒性。 根據(jù)菌體(O)抗原和莢膜(K)抗原可將副溶血性弧菌至少分為13個O血清群和71個K血清型。在1995年以前,與副溶血性弧菌相關(guān)的胃腸炎均由不同種血清型引起。然而,自從1996年2月在印度加爾各答首次爆發(fā)了由副溶血性弧菌引發(fā)的大規(guī)模食物中毒,這種血清型為O3:K6菌株(KP+,tdh+, trh-)迅速在世界各地廣泛流行,尤其以沿海國家和地區(qū)為主。目前將這些1996年以后分離的血清型以O(shè)3:K6為主,包括O4:K68、O1:K25、O1:KUT,經(jīng)脈沖場凝膠電泳(PFGE)、隨機引物PCR(AP-PCR)及多位點序列分析(MLST)鑒定具有非常相似的指紋圖譜(FPs)或序列型(STs)統(tǒng)稱為 流行群‖。高純度基因組DNA的提取 脂多糖(LPS)是細菌外膜重要的組成部分,除此以外,某些革蘭氏陰性菌還產(chǎn)生其它兩種多糖:菌表多糖與莢膜多糖。例如,副溶血性弧菌通過表達大量的菌表多糖形成生物膜,使其有利于在環(huán)境中生存和傳播。無論是哪種形式的多糖都會在一定程度上干擾基因組DNA的提取,同時也影響了DNA的特性。在本研究中,以黏液型細菌副溶血性弧菌RIMD2210633與肺炎克雷伯氏菌NTUH-K2044作為研究模型,以大腸埃希氏菌JM109作為對照,建立兩種適用于提取黏性革蘭氏陰性細菌基因組DNA的新方法。 三種細菌基因組DNA的提取使用了三種方法,每種方法重復(fù)三次。方法Ⅰ為經(jīng)典的飽和酚-氯仿抽提方法,方法Ⅱ與方法Ⅲ都在方法Ⅰ操作基礎(chǔ)上進行了改進,分別增加了乙二醇甲醚或水飽和乙醚的步驟以去除多糖。 三種方法得到的DNA產(chǎn)率各不相同,以方法Ⅰ最高,方法Ⅱ與方法Ⅲ由于增加了去除多糖的步驟明顯降低了DNA產(chǎn)率。將各種方法提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,均有明亮的條帶且無RNA污染與DNA降解。在本研究中,用A260/A280與A260/A230兩個比值來評估三種方法提取的DNA純度,三種方法在A260/A280均處于1.8～2.0,所以表明三種方法提取的DNA均無蛋白的污染。對于A260/A230≥2.0這個指標,只有方法II與方法III適合于所有實驗菌株,而方法Ⅰ只適用于非黏性菌株JM109,對于副溶血性弧菌RIMD2210633與肺炎克雷伯氏菌NTUH-K2044其最高值也僅有1.4左右,因此存在嚴重的多糖污染。 基于上述結(jié)果,本研究建立的方法II與方法III適用于黏性革蘭氏陰性細菌基因組DNA的提取,這兩種方法重復(fù)性高且花費少。當然,這兩種方法也可以應(yīng)用于革蘭氏陽性細菌,只要在細胞裂解步驟(如對金黃色葡萄球菌加入溶葡萄球菌素)中加入溶菌酶即可。由于這兩種方法所需成本較低,因此可大規(guī)模應(yīng)用于黏性細菌基因組DNA的提取。 基于差異分布的大片段基因簇(LVPC)的副溶血性弧菌基因分型 本研究共使用251株副溶血性弧菌(S001-S251),其中包括193株臨床分離株,58株環(huán)境分離株�；谥暗腄NA芯片比較基因組學(M-GCH)研究,我們共篩選得到18個LVPC。用篩選得到的18個LVPC位點對251株副溶血弧菌進行PCR擴增,結(jié)果分別用“1”或“0”表示,其中“1”表示在該LVPC位點PCR擴增結(jié)果為陽性,“0”表示該LVPC位點PCR擴增結(jié)果為陰性。18個LVPC在一株菌中的存在或缺失可形成一個LVPC圖譜,對所有菌株的LVPC圖譜進行統(tǒng)計共有48個獨特的LVPC圖譜,即251株菌可分為48種LVPC型。 根據(jù)獲得的二元的LVPC數(shù)據(jù)通過非加權(quán)組平均法(UPGMA)對251株副溶血性弧菌進行聚類分析,得到最小擴展樹(MS tree)。結(jié)合MS樹與毒力分子標識的分布,將251株菌分成6個群,LVPC-C1～LVPC-C6。將基于LVPC與M-CGH數(shù)據(jù)構(gòu)建的MS樹進行比較,發(fā)現(xiàn)兩者之間的拓撲結(jié)構(gòu)非常相似。另外, LVPC所劃分的5個群(LVPC-C1～LVPC-C5)與M-CGH生成的5個復(fù)合群(C1～C5)相對應(yīng)。而對于LVPC-C6來說,該群只含有一株菌S093,經(jīng)流行群特異性分子標識鑒定非流行群(GS-PCR+,tdh-;PGS+)。S093在基于LVPC所構(gòu)建的MS樹中為一個單獨的單元型,存在于5個復(fù)合群之外,處于LVPC-C2與LVPC-C3之間,且與LVPC-C2遺傳距離較近。其中,LVPC-C2所有菌株(共14株)均為1996年之前分離的舊O3:K6群。LVPC-C3中的所有菌株(63株)經(jīng)流行群特異性分子標識鑒定均為流行群(GS-PCR+, tdh+, trh- ;PGS+)。由于S093處于LVPC-C2與LVPC-C3之間,即“流行群”與“舊O3:K6克隆群”之間,是一種過渡型可定義為“O3:K6的中間型”。這也再次印證了“舊O3:K6克隆群”、“O3:K6的中間型”與“流行群”之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。 總體來說,基于LVPC的分型方法相對于其它方法操作簡單、費用低廉,只需進行普通的PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳即可完成,可在短時間內(nèi)對大量菌株進行分型。當然該方法的分辨率有限,因此可通過另外的分型方法彌補�；诳勺償�(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)的副溶血性弧菌基因分型 本研究共選擇了10個可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)位點用于對251株副溶血性弧菌進行多態(tài)性分析,其中9個VNTR位點在251株實驗菌株中呈現(xiàn)良好的多態(tài)性,1個位點由于在184株菌擴增結(jié)果為陰性,故舍去。在這些位點中位點VP2-7、VPTR1及VPTR6均呈現(xiàn)出較高的等位基因多態(tài)性,而位點VP1-10,VP1-11呈現(xiàn)出非常低的等位基因多態(tài)性。 基于LVPC聚類分析結(jié)果,不同LVPC群的菌株由不同顏色標記,將這些有顏色標記的菌株的VNTR數(shù)據(jù)導(dǎo)入生物學軟件BioNumerics 5.01,利用UPGMA方法對251株菌構(gòu)建了MS樹。將251株菌最終分成了222個基因型,基因型的差異主要是重復(fù)序列拷貝數(shù)不同造成的。只有來自LVPC-C2中大部分菌株與LVPC-C3在基于VNTR數(shù)據(jù)構(gòu)建的MS樹聚類到一起,而LVPC-C1、LVPC-C4及LVPC-C5在該MS樹呈散在分布。 上述結(jié)果說明基于VNTR的分型方法具有極高的分辨率,幾乎可以將每株菌分開(251株菌分成222個VNTR型),包括那些同源性較高的流行群,這種區(qū)分能力是別的分型方法很難達到的。然而,大多數(shù)菌株在基于VNTR數(shù)據(jù)構(gòu)建的MS樹中呈散在分布,因而很難判斷菌株之間的親緣關(guān)系,其主要是由于VNTR的重復(fù)數(shù)在菌株中高度可變以至于無法對大量菌株進行整體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,但是由于該方法本身的優(yōu)點如高分辨率與高通量,可用于對菌株的快速鑒定及親緣關(guān)系較近菌株的區(qū)分。 二級基因分型法 本研究目的是將兩種分型方法相結(jié)合以梯階式分析將親緣關(guān)系遠近的菌株區(qū)分開,簡單的說即用一種分型方法將菌株大致分為幾個群,隨后采用分辨率較高的分型方法對同一群中的菌株分為不同的型。這樣不僅提高方法的分辨能力,而且能將一種分型方法的不足由另外一種分型方法彌補。本研究建立了一種新的基因分型方法用于鑒定菌株以及判斷菌株之間的親緣關(guān)系。首先通過操作簡便快速的基于18個LVPC位點的分型方法和5個毒力分子標識(GS-PCR, tdh, T3SS2α, trh和T3SS2β)先將251株菌按其致病性進行初步分類,得到6個LVPC群,隨后再利用基于VNTR的二級分型方法將每個LVPC群進行更精細的區(qū)分。 將6個LVPC群的菌株基于VNTR數(shù)據(jù)分別構(gòu)建了MS樹,LVPC-C1分成了34個等位基因型,LVPC-C2為13,LVPC-C3為55,LVPC-C4為70,LVPC-C5為49。 總之,基于LVPC與VNTR的二級基因分型方法對于區(qū)分副溶血性弧菌是一種非常實用的方法。該方法得到的分型結(jié)果易于判讀、具有很好的重復(fù)性以及在一定程度上實現(xiàn)了高通量,可對大量全球收集的菌株建立遺傳指紋圖譜樣數(shù)據(jù)庫,從而有利于副溶血性弧菌的鑒定、分型、溯源及風險評估。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【引證文獻】

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1 郭李平;徐鑌蕊;杜德燕;姜漢雯;邱業(yè)峰;周冬生;;副溶血弧菌毒力評價小鼠模型的建立與應(yīng)用[J];中國實驗動物學報;2012年04期

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本文編號：1407394