發(fā)布時間：2018-01-10 19:33

  本文關(guān)鍵詞：自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞組織工程化神經(jīng)修復(fù)獼猴正中神經(jīng)50mm缺損的實驗研究　出處：《蘇州大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 骨髓基質(zhì)細(xì)胞 組織工程化神經(jīng) 正中神經(jīng) 獼猴

【摘要】：目的: 探討獼猴骨髓基質(zhì)細(xì)胞(rhesus monkey bone marrow stromal cells, RhBMCSs)的生物學(xué)特性以及其與支架材料聚乳酸乙醇酸(poly lactide-co-glycolide acid,PLGA)在體外的生物相容性,并觀察自體RhBMCSs作為種子細(xì)胞與殼聚糖導(dǎo)管和PLGA纖維支架構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)移植修復(fù)獼猴周圍神經(jīng)長距離缺損的能力及其安全性,為該組織工程化神經(jīng)的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 方法: 1、應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法從成年獼猴骨髓中分離RhBMCSs,檢測細(xì)胞表面抗原、細(xì)胞周期、生長增殖能力及分化能力。 2、將第二代RhBMCSs與PLGA支架材料聯(lián)合培養(yǎng),通過共焦顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),應(yīng)用MTT法檢測RhBMCSs活性,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,應(yīng)用實時熒光PCR和Western Blot檢測RhBMCSs神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌情況。 3、建立獼猴正中神經(jīng)50mm缺損模型并隨機(jī)分為4組(每組3只):細(xì)胞組用由殼聚糖導(dǎo)管及置入其中的PLGA支架組成的神經(jīng)移植物橋接缺損神經(jīng)并注入自體RhBMCSs;材料組僅以神經(jīng)移植物橋接而不加細(xì)胞;自體組用自體神經(jīng)原位移植;缺損組不予任何橋接。術(shù)后3、6、9、12個月分別對各組動物術(shù)肢大魚際肌及對指功能等情況進(jìn)行拍照、攝像記錄。術(shù)后12個月,進(jìn)行神經(jīng)電生理和熒光金逆行示蹤檢測;運用光鏡和電鏡組織學(xué)方法對再生神經(jīng)和靶肌肉進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光化學(xué)檢測,利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行形態(tài)計量分析。術(shù)前及術(shù)后3、6、9、12個月對所有動物抽取外周血液進(jìn)行血液常規(guī)、生化和凝血功能檢查,并且于術(shù)后12個月時行免疫功能指標(biāo)、腫瘤標(biāo)志物檢測及重要臟器組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果: 1、RhBMCSs呈梭形、成纖維細(xì)胞樣,表達(dá)CD73、CD105、CD29和CD90,而不表達(dá)CD34、CD45和CD11b,第二代RhBMSCs G0/G1期、S期和G2期所占的百分比分別為83.36%、12.71%和3.93%,符合基質(zhì)干細(xì)胞的特性。 2、RhBMCSs與PLGA共培養(yǎng)24h后,可見部分細(xì)胞呈球形或短梭形貼附與纖維支架表面,此后細(xì)胞沿PLGA纖維延伸,逐漸轉(zhuǎn)為長梭形,激光共焦顯微鏡下可見CD29陽性的BMSCs黏附包繞在PLGA纖維表面,形成長長的細(xì)胞鏈。掃描電鏡下可見BMSCs與PLGA貼附良好,且有較多細(xì)長的突起從BMSCs伸出,沿著材料伸展。RhBMCSs在PLGA浸出液中培養(yǎng)至7天,其形態(tài)和細(xì)胞活力與普通培養(yǎng)基組相比無明顯差異(P0.05)。兩組間細(xì)胞增殖指數(shù)(G2M + S)/G0G1 + G2M+S)亦無差異(P0.05)。在PLGA浸出液中培養(yǎng)72h后,獼猴BMSCs神經(jīng)營養(yǎng)因子(NGF、BDNF,CNTF及bFGF) mRNA表達(dá)量及蛋白表達(dá)量與普通培養(yǎng)基中生長的BMSCs相比沒有顯著差異(P0.05)。 3、神經(jīng)移植術(shù)后動態(tài)地觀察獼猴術(shù)側(cè)手臂使用頻率、拇指力量及手指運動功能,細(xì)胞組、材料組和自體神經(jīng)組呈漸進(jìn)性恢復(fù),12個月時,細(xì)胞組及自體神經(jīng)組動物手指靈活,拇指與食指對指功能優(yōu)于材料組,缺損組動物拇指外展困難,對指功能喪失,大魚際肌逐漸萎縮。術(shù)后12個月神經(jīng)電生理學(xué)檢測示材料組、細(xì)胞組、自體神經(jīng)組再生正中神經(jīng)遠(yuǎn)側(cè)端復(fù)合肌動作電位(CMAP)平均波幅分別為:4.63±0.13mV,4.45±0.49 mV,8.89±2.85 mV,材料組及細(xì)胞組與自體組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);近側(cè)端CMAP平均波幅分別為:3.63±1.14mV,3.82±0.41 mV,6.50±2.51 mV,三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);平均運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度分別為:12.87±2.14 m/s、18.59±4.87 m/s、30.21±2.90 m/s,三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。熒光金(FG)逆行示蹤檢查示材料組、細(xì)胞組、自體神經(jīng)組術(shù)側(cè)相應(yīng)節(jié)段脊髓灰質(zhì)前角運動神經(jīng)元中FG陽性細(xì)胞數(shù)分別為15292±1005、15814±600和16000±841,三組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);相應(yīng)背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元中FG標(biāo)記率分別為76.14%±7.62%、79.61%±6.60%和82.79%±5.11%,細(xì)胞組與自體神經(jīng)組無統(tǒng)計學(xué)差異,但導(dǎo)管組FG標(biāo)記率低于細(xì)胞組和自體神經(jīng)組(P0.05)。術(shù)后12個月,材料組和細(xì)胞組移植部位殼聚糖導(dǎo)管和PLGA纖維支架已完全降解,再生組織連接了正中神經(jīng)50mm缺損。神經(jīng)三色染色和抗NF200、S-100免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果顯示,材料組、細(xì)胞組、自體神經(jīng)組再生神經(jīng)纖維從近側(cè)端穿越橋接段,長入了遠(yuǎn)側(cè)神經(jīng)干,細(xì)胞組橋接物段再生神經(jīng)纖維密集,好于材料組,缺損組未見再生神經(jīng)結(jié)構(gòu)。透射電鏡下,材料組、細(xì)胞組、自體神經(jīng)組再生神經(jīng)遠(yuǎn)段神經(jīng)橫切面神經(jīng)髓鞘厚度分別為:0.63±0.27μm、0.82±0.39μm、1.11±0.58μm,各組之間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P 0.05);有髓神經(jīng)直徑分別為:4.09±1.12μm、4.59±1.39μm、5.57±2.13μm,各組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P 0.05),缺損組神經(jīng)變性萎縮明顯,幾乎看不到正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)。大魚際肌Masson三色染色后可見細(xì)胞組和自體神經(jīng)組肌纖維比較飽滿,肌束之間可見少量膠原纖維增生,材料組肌束之間見較多膠原纖維增生;缺損組大魚際肌表現(xiàn)為明顯的失神經(jīng)萎縮,膠原纖維、結(jié)締組織和脂肪組織大量增生。材料組、細(xì)胞組、自體神經(jīng)組大魚際肌肌纖維平均橫截面積分別為: 658.84±420.84μm~2、696.80±357.60μm~2、1232.54±335.79μm2,材料組和細(xì)胞組與自體神經(jīng)組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P 0.05 )。材料組、細(xì)胞組、自體神經(jīng)組大魚際肌膠原纖維面積平均百分比分別為: 29.62±10.01%、23.04±8.77%、22.65±6.41%,材料組與自體神經(jīng)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異( P 0.05 ),細(xì)胞組與自體神經(jīng)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P 0.05 )。術(shù)后各組獼猴血常規(guī)、血電解質(zhì)、肝功能、腎功能、心酶譜、血糖、血脂及凝血功能檢查,結(jié)果均在正常范圍,與術(shù)前相比及各組間相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。術(shù)后12個月檢測免疫功能指標(biāo),各組間結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異,術(shù)后12個月行腫瘤標(biāo)志物檢測,所有動物均未見異常。術(shù)后12個月行心、肝、肺、腎、脾及淋巴結(jié)組織病理學(xué)檢查,各臟器未見病理學(xué)改變。 結(jié)論: 1、應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法所得RhBMSCs在第2-3代時形態(tài)均一,增殖旺盛,其生物學(xué)特性符合干細(xì)胞特征,可以用于構(gòu)建組織工程化神經(jīng)移植物。 2、RhBMSCs能在PLGA支架上貼附生長,未見PLGA對細(xì)胞活力、分裂增殖能力及神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的不良影響,表明RhBMSCs與PLGA支架材料有良好的生物相容性。 3、由自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞、殼聚糖導(dǎo)管和聚乳酸乙醇酸纖維支架構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)橋接獼猴50mm正中神經(jīng)缺損,術(shù)后12個月再生神經(jīng)修復(fù)了缺損,恢復(fù)了神經(jīng)干的連續(xù)性,再生神經(jīng)在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能上都得到了恢復(fù),并實現(xiàn)了靶肌的神經(jīng)再支配,獼猴術(shù)肢的運動功能得到了改善。 4、血液檢查及重要臟器組織病理學(xué)檢查表明該組織工程化神經(jīng)應(yīng)用于靈長類動物獼猴體內(nèi)是安全的。 本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞組織工程化神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)損傷提供了實驗依據(jù),具有指導(dǎo)意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 路艷蒙,傅文玉,樸英杰,喬東訪,安連兵;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)[J];電子顯微學(xué)報;2002年04期

2 王曉冬,張沛云,陳罡,吳堅,胡文;人工組織神經(jīng)移植物修復(fù)狗缺損坐骨神經(jīng)后腓腸肌的形態(tài)觀察[J];解剖學(xué)報;2003年03期

3 王啟偉,王萬山,樸英杰;恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性[J];解剖學(xué)報;2004年02期

4 楊光照;;獼猴項目基地建設(shè)可行性分析[J];林業(yè)建設(shè);2007年02期

5 王曉冬,顧曉松,張沛云,王東,呂廣明;三色染色法和免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示培養(yǎng)的神經(jīng)軸索及雪旺細(xì)胞[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2000年03期

6 高昆;陸燕蓉;李勝富;叢聰;袁宇;張杰;程驚秋;李宏霞;王莉;;恒河猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及其生長特性[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2007年06期

7 代飛,吳軍,易紹萱,賀偉峰,陳希煒,張小容;端粒酶表達(dá)延長人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生命周期的實驗[J];中國臨床康復(fù);2005年02期

8 劉麗輝,孫昭,孫琪云,黃雅靜,滿秋紅,郭梅,趙春華,艾輝勝;獼猴間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2005年03期

9 胡稷杰,裴國獻(xiàn),全大萍,金丹,魏寬海,黃愛文;新型聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)支架的細(xì)胞相容性研究[J];中華創(chuàng)傷骨科雜志;2005年04期

10 李德志;萬虹;揚飛;歷俊華;陳剛;屈雪;孫異臨;王身國;王忠誠;;施萬細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞在PLGA支架中共培養(yǎng)的掃描電鏡觀察[J];中華神經(jīng)外科雜志;2006年03期

，

本文編號：1406569