本文關(guān)鍵詞：ccr5、vif和pol基因的人工miRNA的構(gòu)建與篩選　出處：《南華大學(xué)》2012年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： HIV RNAi miRNA vif pol ccr5

【摘要】：背景及目的：RNAi在HIV-1的治療研究中得到了廣泛的應(yīng)用,構(gòu)建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是開(kāi)展相關(guān)研究的基礎(chǔ)。siRNAs或miRNAs可以特異地結(jié)合靶mRNA，引起靶mRNA降解或翻譯抑制，最終導(dǎo)致基因特異性沉默。輔助受體（CCR5或CXCR4）是HIV進(jìn)入被感染細(xì)胞所必需的。研究發(fā)現(xiàn)，基因CCR5delta32序列缺失可以減緩或抵抗HIV-1感染，但機(jī)體未出現(xiàn)免疫異常�；騰if是感染性因子，可能影響游離HIV感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播。基因pol編碼多種酶，如逆轉(zhuǎn)錄酶，蛋白酶，對(duì)HIV的復(fù)制有重要作用。本實(shí)驗(yàn)分別以ccr5，vif，pol為靶基因，構(gòu)建miRNA,從中篩選出來(lái)基因效率較高的miRNAs。 方法：第一步，選擇保守型較好的ccr5，vif，pol基因?yàn)榘袇^(qū)，，合成基因序列，克隆入載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，最后通過(guò)qPCR篩選高效表達(dá)ccr5、vif和pol基因的293T細(xì)胞。第二步，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物并分別合成針對(duì)ccr5、vif和pol基因的人工miRNA各4對(duì)。第三步，以天然miR-155為基礎(chǔ)骨架構(gòu)建了分別靶向ccr5，vif，pol的人工miRNA元件，通過(guò)與HIV-1感染性克隆質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證獲得了可有效抑制HIV-1表達(dá)的人工miRNA元件。通過(guò)與攜帶靶序列的報(bào)告質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明ccr5-miRNA，vif-miRNA和pol-miRNA具有良好的沉默效果。 結(jié)果：通過(guò)干擾效果評(píng)價(jià)，得到了干擾效果較強(qiáng)的ccr5-miRNA、vif-miRNA和pol-miRNA，其對(duì)靶基因的干擾效果分別達(dá)到了72%、68%和76%。 結(jié)論：得到了高效表達(dá)ccr5，vif，pol基因的293T細(xì)胞；構(gòu)建和篩選到了各種基因沉默效率最好的miRNA，其干擾效率分別為72%、68%和76%。
[Abstract]:Background and objective: RNAi has been widely used in the treatment of HIV-1. The construction of efficient and safe RNAi antiviral elements is the basis of related research. SiRNAs or miRNAs can specifically bind to target mRNAs and cause target mRNA degradation or translation inhibition. The coreceptor CCR5 or CXCR4 is necessary for HIV to enter infected cells. Gene CCR5delta32 deletion can slow down or resist HIV-1 infection, but there is no immune abnormality. Gene vif is an infectious factor, which may affect the infection of free HIV. The gene pol encodes a variety of enzymes, such as reverse transcriptase and protease, which play an important role in the replication of HIV. MiRNAs with high gene efficiency were selected from miRNAs. Methods: in the first step, the conserved ccr5 vifpol gene was selected as the target region, the gene sequence was synthesized and cloned into the vector and transfected into 293T cells. Finally, 293T cells expressing ccr5vif and pol genes were screened by qPCR. In the second step, primers were designed according to gene sequence and synthesized respectively for ccr5. In the third step, the artificial miRNA elements targeting ccr5 vifopol were constructed based on the skeleton of natural miR-155. An artificial miRNA element was obtained by co-transfection inhibition experiment with HIV-1 infectious clone plasmids. The co-transfection experiment with the reporter plasmid carrying target sequence showed that the artificial miRNA element could effectively inhibit the expression of HIV-1. Prove ccr5-miRNA. Vif-miRNA and pol-miRNA have good silencing effect. Results: through the evaluation of interference effect, we got the good interference effect of ccr5-miRNA-vif-miRNA and pol-miRNA. Its interference effect on target gene reached 72% and 76% respectively. Conclusion: 293T cells with high expression of ccr5 vifopol gene were obtained. The miRNAs with the best gene silencing efficiency were constructed and screened, and the interference efficiency was 722% and 76%, respectively.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1406383