本文關(guān)鍵詞：樹突狀細(xì)胞分化成熟的表觀遺傳組學(xué)研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell,DC)于1973年被Steiman和Cohn首次從脾臟中分離出來,隨后的一系列研究發(fā)現(xiàn)其在免疫識別、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要作用,因此,有關(guān)DC的免疫生物學(xué)基礎(chǔ)研究及其與臨床疾病發(fā)生發(fā)展和治療的應(yīng)用性研究是當(dāng)今免疫學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c。DC來源于造血干細(xì)胞,其在免疫應(yīng)答的首要環(huán)節(jié)——抗原識別與提呈中扮演著重要的角色。免疫系統(tǒng)中的DC主要存在兩種功能狀態(tài):未成熟DC(immature DC,imDC)和成熟DC(mature DC, mDC),不同的成熟狀態(tài)決定了DC不同的功能特性,imDC具有很強的攝取和加工抗原的能力,并能夠通過其表面的趨化因子受體,通過血液和淋巴系統(tǒng)遷移入淋巴結(jié)和脾;imDC在攝取抗原和炎癥信號的刺激下轉(zhuǎn)變?yōu)閙DC,mDC抗原提呈能力明顯增強,高表達共刺激分子和T細(xì)胞區(qū)的趨化因子受體,并分泌大量的細(xì)胞因子,激活T細(xì)胞,觸發(fā)T細(xì)胞的增殖和分化。同時其分泌的炎性細(xì)胞因子和趨化因子能夠吸引和活化天然免疫細(xì)胞以形成免疫應(yīng)答與調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)。DC作為免疫系統(tǒng)中功能最強大的專職抗原提呈細(xì)胞(Antigen-presenting cells, APC),是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁,有關(guān)DC分化發(fā)育、功能調(diào)控機制的研究仍然有問題尚不明了,DC與疾病發(fā)生發(fā)展關(guān)系與治療的應(yīng)用研究也有待于進一步深入探討與驗證。 作為獨立于基因組序列本身,以整個染色質(zhì)組成及其動態(tài)調(diào)控為研究對象的表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)成為了21世紀(jì)極為重要的生命學(xué)科之一。經(jīng)歷從1842年至今的巨大發(fā)展,表觀遺傳學(xué)逐漸走向成熟,形成了以DNA甲基化、組蛋白修飾、能量依賴的染色質(zhì)重塑、核小體的動態(tài)重組以及非編碼RNA研究為核心的主流生命科學(xué)學(xué)科。各種表觀遺傳學(xué)事件在不同層次的相互作用和整合,建立和維持了不同的基因表達模式,嚴(yán)格的控制著從受精卵到完整生命體的分化發(fā)育全過程,成熟體各種細(xì)胞表型的維持以及與外界環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的應(yīng)答和反應(yīng),從而在機體的整個生理條件下發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。在組學(xué)背景下,利用芯片以及第二代測序技術(shù),在全基因組水平系統(tǒng)全面的研究表觀遺傳修飾圖譜的表觀遺傳組學(xué)(Epigenome)也應(yīng)運而生。系統(tǒng)、綜合地在全基因組水平上繪制細(xì)胞乃至各實體分化,發(fā)育的動態(tài)DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、non-coding RNA組,已經(jīng)成為系統(tǒng)深入地研究生命發(fā)生本質(zhì)和疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段。 近十年來,免疫學(xué)研究的發(fā)展突飛猛進,基礎(chǔ)免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)三大方面齊頭并進,同時免疫學(xué)與其他生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)科的交叉更加深入和廣泛,在組學(xué)時代的宏觀背景下,免疫組學(xué)也逐漸形成。同時伴隨著功能基因組學(xué)時代的浪潮,免疫組學(xué)與各種組學(xué)研究也開始相互融合,越來越多的免疫學(xué)家開始把各種組學(xué)研究運用到免疫模型中去解決免疫學(xué)的根本性科學(xué)問題。表觀遺傳組學(xué)也開始應(yīng)用到免疫細(xì)胞分化發(fā)育,以及免疫相關(guān)疾病和血液腫瘤的研究中。T細(xì)胞、B細(xì)胞的全基因組DNA甲基化譜已經(jīng)開始利用低分辨率的技術(shù)手段進行繪制,與此同時,通過染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合測序(ChIP-sequencing)繪制全基因組組蛋白修飾譜,也應(yīng)用到免疫學(xué)研究中,國外幾個實驗室開展了CD4+T細(xì)胞分化過程中(naive, Th1, Th2,Th17, iTreg, and natural Treg (nTreg) cell)的組蛋白修飾譜研究,并結(jié)合基因表達譜來找尋組蛋白修飾在調(diào)控不同類型基因中的共同規(guī)律。關(guān)于DC分化、成熟及其功能的表觀遺傳調(diào)控研究才起步,大多數(shù)研究尚集中在對一些DC的功能性細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控,如組蛋白甲基化修飾對IL-12的調(diào)控,以及HDAC11對IL-10的負(fù)調(diào)控作用等等,同時抗原提呈關(guān)鍵分子MHC II類分子及其調(diào)控因子CIITA在DC成熟和活化中也受到表觀因子的調(diào)控,但目前尚沒有從DC的分化和特異功能的角度來探討表觀修飾因子調(diào)控DC的標(biāo)志性研究。 表觀遺傳學(xué)通過對染色質(zhì)狀態(tài)的調(diào)控,控制著細(xì)胞特異性基因群體在特定的時間和空間的開啟與關(guān)閉。特定的細(xì)胞群體,在外界信號的作用下,或者在分化發(fā)育過程中,建立起自身獨特性的DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜以及非編碼RNA組,通過這些表觀調(diào)控因子在全基因組范圍內(nèi)的整合和相互作用,建立起組織和細(xì)胞特異性的表觀遺傳組,而反過來表觀遺傳組又能夠建立細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄組,從而使特定細(xì)胞群體獲得其特異的功能狀態(tài),從而建立了out-in-out的調(diào)控模式,決定了細(xì)胞的分化發(fā)育命運。 從表觀遺傳學(xué)的觀點,單一的細(xì)胞群體,特別是人的原代細(xì)胞的特異性表觀遺傳組圖譜,會具有怎樣的典型特征呢? DNA甲基化譜、組蛋白修飾組、非編碼RNA組以及染色質(zhì)重塑復(fù)合體,在人的原代細(xì)胞的分化發(fā)育過程中,又是如何相互作用和相互影響,在DNA、組蛋白以及與其相結(jié)合的RNA和蛋白質(zhì)的各個層次和三維空間中,建立起細(xì)胞特有的表觀遺傳組的呢? 從特定免疫細(xì)胞群體,如樹突狀細(xì)胞(DC)等出發(fā),哺乳動物,特別是人的血液系統(tǒng)和免疫器官中特定原代免疫細(xì)胞,在特定的信號,如細(xì)胞因子作用和感染刺激的誘導(dǎo)下,是如何通過外界信號的傳遞,從胞外-胞膜-胞漿-胞核,由外而內(nèi)的傳遞DC分化成熟信號,通過外界信號活化和誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,非編碼RNA等建立起信號特異性的動態(tài)的特征性表觀遺傳組?再從胞核-胞漿-胞膜-胞外,由內(nèi)而外的,通過表觀遺傳因子的特異性調(diào)控,決定關(guān)鍵基因的開啟與關(guān)閉,從而建立起未成熟DC(imDC)、成熟DC(mDC)的特異性功能特征,如抗原攝取、加工、提呈能力的差異性調(diào)控,DC特異性細(xì)胞因子和抗菌分子的分泌? 基于以上研究進展和現(xiàn)狀分析,針對以上科學(xué)問題的思考,我們利用深度測序技術(shù),以表觀遺傳組學(xué)為研究手段,深入研究了人單核細(xì)胞,以及由其體外分化而來的人未成熟DC與成熟DC的動態(tài)的、以單個核苷酸為分辨率的全基因組DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、表達譜以及小RNA組,系統(tǒng)闡述了新鮮分離純化的人免疫細(xì)胞群體的特征性表觀遺傳組,以及各表觀調(diào)控因子之間的相互關(guān)系,并通過尋找DC分化成熟過程中的差異表觀修飾位點,來進一步揭示炎癥信號如何通過由外到內(nèi)的傳遞,特異性的介導(dǎo)表觀修飾的改變,而又通過這些表觀修飾來影響關(guān)鍵基因,如轉(zhuǎn)錄因子的表達,從而使DC具備了其特異性的功能狀態(tài),由此建立了特異性信號誘導(dǎo)——差異表觀修飾位點——關(guān)鍵基因表達改變的研究思路,為尋找調(diào)控DC分化發(fā)育的關(guān)鍵分子,特別是核內(nèi)的調(diào)控因子奠定了實驗基礎(chǔ)。 同時,考慮到專職定位于核內(nèi)的小RNA的研究目前尚是空白,我們通過小鼠成熟DC(mDC)胞漿、胞核小RNA組的建立,從另一個表觀遺傳調(diào)控因子——非編碼小RNA的視角,來尋找和研究細(xì)胞核內(nèi)的調(diào)控性小RNA的分布和序列特征,并結(jié)合DC的功能特點,初步探討了這些核內(nèi)小RNA是如何特異性地靶向關(guān)鍵基因的調(diào)控區(qū)域,來介導(dǎo)表觀修飾的改變,從而控制DC特異功能基因的開啟和關(guān)閉的。 一.人單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞分化成熟的動態(tài)表觀遺傳組學(xué)圖譜的建立和表觀調(diào)控機制的初步研究 為了應(yīng)用表觀遺傳組學(xué)的技術(shù)手段來分析人DC分化成熟的表觀調(diào)控機制,我們分離了單個正常人的CD14+單核細(xì)胞,并體外誘導(dǎo)分化為imDCs,并進一步用LPS刺激imDCs,誘導(dǎo)其成為mDCs。提取這三種細(xì)胞的DNA、RNA以及以組蛋白修飾為研究對象,進行ChIP實驗,獲得ChIP-DNA,將所得產(chǎn)物進行DNA甲基化譜測序、表達譜測序、小RNA組測序、ChIP-seq,建立了三種細(xì)胞的以單個核苷酸為分辨率的DNA甲基化譜、組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3的全基因組修飾譜、基因表達差異的表達譜、小RNA表達差異的小RNA組,將這些數(shù)據(jù)進行整合研究,發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞中全基因組DNA甲基化主要以CG為背景的C的甲基化為主,占99%以上,同時三種細(xì)胞的甲基化率均一性較強,80%以上的以CG為背景的甲基化的C(mCG)的甲基化率均在90%以上,同時在monocyte分化為imDC的過程中,發(fā)生了廣泛的DNA去甲基化。組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3在全基因組的分布分析顯示,二者在基因的CDS區(qū)較少富集,同時我們發(fā)現(xiàn)H3K4me3和H3K27me3共修飾的區(qū)域其DNA甲基化率明顯低于H3K4me3和H3K27me3單獨富集的區(qū)域,在單核細(xì)胞中尤為明顯。這可能也反映了H3K4me3和H3K27me3共修飾的區(qū)域,通過DNA的低甲基化保持了可誘導(dǎo)活化或抑制的調(diào)控潛能。通過進一步分析基因組各元件的DNA甲基化特征,我們發(fā)現(xiàn)CG的密度與甲基化率存在負(fù)相關(guān),CG高密度區(qū)的DNA甲基化率較低。同時不同的基因組元件也有其各自的DNA甲基化分布模式。 單細(xì)胞分析基因表達量與DNA甲基化和組蛋白修飾的關(guān)系,我們發(fā)現(xiàn)高表達的基因其啟動子區(qū)的DNA甲基化率較低,但在其轉(zhuǎn)錄區(qū),特別是第一個intron之后的轉(zhuǎn)錄區(qū),其DNA甲基化與基因表達是正相關(guān)的。而遠(yuǎn)端的啟動子區(qū),也能觀察到DNA甲基化與表達量的正相關(guān)關(guān)系。而microRNA表達豐度與DNA甲基化的關(guān)系,卻有不同,microRNA轉(zhuǎn)錄區(qū)的DNA甲基化是明顯地高甲基化對應(yīng)低表達,這說明了microRNA和蛋白編碼基因的DNA甲基化調(diào)控模式是不同的。同時組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3主要集中在TSS附近,H3K4me3富集于高表達基因,而H3K27me3富集于低表達基因,說明了二者對于基因表達的不同調(diào)控作用。 我們進一步分析了基因表達和表觀修飾在三種細(xì)胞中的動態(tài)變化特征,基因表達的雷達圖分析表明,DC分化成熟時,伴隨著廣泛的基因表達變化,說明了三種細(xì)胞不同的功能狀態(tài),從蛋白編碼基因表達變化圖中可以看出,在monocyte-imDC-mDC分化成熟過程中,先升高后降低的變化基因較少,也說明了DC和單核細(xì)胞在基因表達和功能上的異質(zhì)性。而microRNA的表達差異分析表明,表達量顯著降低的microRNA較多,也反映了單核細(xì)胞分化為DC的過程中,通過下調(diào)microRNA來解除對一些基因表達的抑制,從而獲得更多的功能。PCA分析表明,DNA甲基化相對于組蛋白修飾和microRNA,在三種細(xì)胞中是比較穩(wěn)定的。通過DC功能相關(guān)pathways的基因啟動子區(qū)的DNA甲基化分析表明,這些pathways中大多數(shù)基因在單核細(xì)胞分化為imDC時發(fā)生了DNA的去甲基化,為這些基因的高表達或后期的激活做好準(zhǔn)備。通過DNA甲基化和組蛋白修飾以及microRNA的聚類分析發(fā)現(xiàn),DNA甲基化和組蛋白H3K27me3的動態(tài)變化呈現(xiàn)相同的變化趨勢,特別是對于H3K27me3高富集的區(qū)域,說明了二者的共調(diào)控關(guān)系。 DNA甲基化在單核細(xì)胞分化為imDC的過程中略微降低,但在imDC成熟時,DNA甲基化從整體水平上看較為穩(wěn)定,那么DNA甲基化是如何參與調(diào)控DC成熟的呢?我們通過尋找imDC-mDC的差異甲基化區(qū)域(differential methylated regions, DMRs),發(fā)現(xiàn)DNA甲基化能夠調(diào)控一些轉(zhuǎn)錄因子。眾所周知,轉(zhuǎn)錄因子對于細(xì)胞的分化和功能狀態(tài)的調(diào)控是極其重要的。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子FLI1、HSF4和EGR1啟動子的特定區(qū)域,在DC成熟時,經(jīng)歷了DNA甲基化水平的升高,而其表達卻顯著降低。我們進而以EGR1為研究對象,探討了EGR1在DC分化成熟中的功能,通過EGR1的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)EGR1在imDC中傾向于調(diào)控細(xì)胞表面分子的表達,通過慢病毒介導(dǎo)的gain-and-loss研究,發(fā)現(xiàn)EGR1能夠抑制CD86,CD48,CD58的表達,從而抑制DC的成熟,可見,為了促進CD86,CD48,CD58的表達而使DC更好地激活T細(xì)胞,促DC成熟信號可以通過調(diào)控DNA甲基化而抑制了EGR1的表達,從而促進了DC成熟及其T細(xì)胞激活功能。 二.小鼠成熟樹突狀細(xì)胞(mDC)核內(nèi)小RNA組的建立、特征分析以及初步功能探討 隨著非編碼RNA研究的深入,非編碼小RNA的存在及功能越來越受到關(guān)注。siRNA作為植物中存在的內(nèi)源性小RNA,能夠以全序列匹配的方式介導(dǎo)靶mRNA的降解,microRNA作為一種更加廣泛存在于動植物中的非編碼小RNA,以部分序列匹配的方式參與細(xì)胞內(nèi)mRNA的降解和翻譯的抑制。siRNA在植物中能夠介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄水平的表觀調(diào)控,如介導(dǎo)基因啟動子區(qū)的DNA甲基化的修飾,但哺乳動物中現(xiàn)今并沒有找到一類介導(dǎo)表觀調(diào)控的小RNA,基于此,我們以小鼠mDC為細(xì)胞模型來尋找哺乳動物中是否存在一類主要定位于核內(nèi),專職介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的表觀調(diào)控的小RNA。我們分離mDC的胞漿、胞核兩個組分的RNA,進行小RNA測序研究,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)的小RNA組的組分和特征有別于胞漿小RNA組,來源于重復(fù)序列,核小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)的小RNA主要定位于核內(nèi),而microRNA則主要定位在細(xì)胞漿中,同時核內(nèi)的小RNA的長度分布也并不類似于胞漿中以22nt為主的分布,富集于核內(nèi)的小RNA的5`端以A、T為主,3`端為C的比例較低,而在20-23nt的small RNAs中,較多以G結(jié)尾。我們將主要富集于核內(nèi)的小RNA命名為nlsRNA(nulear localized small RNA),這類RNA產(chǎn)生部分依賴于Dicer酶的加工,但他們都不與AGO家族的蛋白相結(jié)合。 基于這類nlsRNA可能通過與啟動子部分匹配的模式來介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的表觀調(diào)控,我們分析了Dicer不依賴的nlsRNAs中表達量最高的一個nlsRNA,即nlsR-3的seed sequence與小鼠基因啟動子區(qū)的互補位點,發(fā)現(xiàn)nlsR-3能夠特異性靶向小鼠iNOS啟動子區(qū)的關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域,同時通過其模擬物過表達和抑制物干擾等手段,發(fā)現(xiàn)其能夠抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的轉(zhuǎn)錄。進一步研究其對iNOS表達的調(diào)控機制,發(fā)現(xiàn)nlsR-3能夠介導(dǎo)染色質(zhì)重塑抑制蛋白Mi-2β特異性靶向iNOS的啟動子區(qū),抑制iNOS的表達,同時能夠增加抑制性組蛋白修飾H3K27me3在iNOS啟動子區(qū)的產(chǎn)生來抑制iNOS的表達,并通過二者維持細(xì)胞靜息狀態(tài)下iNOS啟動子區(qū)的染色質(zhì)關(guān)閉狀態(tài)。 綜上所述,我們通過大規(guī)模測序建立了人DC分化成熟的DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、mRNA表達譜和小RNA組,以及小鼠mDC的核小RNA組,以表觀遺傳組學(xué)的角度從面、線、點較深入地研究了表觀調(diào)控因子如何通過特異性調(diào)控DC功能相關(guān)的關(guān)鍵分子的表達來調(diào)控DC的分化成熟。我們系統(tǒng)分析了人DC分化成熟過程中的差異表觀修飾位點和差異表達基因,發(fā)現(xiàn)了DC成熟過程中受DNA甲基化調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。通過核質(zhì)分離小鼠mDC的小RNA,并結(jié)合高通量測序,我們發(fā)現(xiàn)了一群新的定位于核內(nèi)的小RNA,并初步探討了其介導(dǎo)表觀修飾酶特異性靶向DC功能相關(guān)基因的啟動子區(qū),調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的新機制。大量組學(xué)數(shù)據(jù)的獲得,為關(guān)于DC的表觀調(diào)控研究提供了特異性信息分析數(shù)據(jù)平臺,也為在染色質(zhì)水平干預(yù)DC功能,以及以表觀調(diào)控為視角來提高DC疫苗效率、設(shè)計新的免疫治療調(diào)控靶點和藥物靶標(biāo)提供了線索和新的研究方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 任松葉;人類及酵母基因組功能區(qū)的核小體定位預(yù)測[D];內(nèi)蒙古科技大學(xué);2012年

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本文編號：1403172