本文關鍵詞：樹突狀細胞分化成熟的表觀遺傳組學研究　出處：《第二軍醫(yī)大學》2011年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)于1973年被Steiman和Cohn首次從脾臟中分離出來,隨后的一系列研究發(fā)現其在免疫識別、免疫應答和免疫調控中發(fā)揮著重要作用,因此,有關DC的免疫生物學基礎研究及其與臨床疾病發(fā)生發(fā)展和治療的應用性研究是當今免疫學領域的前沿熱點。DC來源于造血干細胞,其在免疫應答的首要環(huán)節(jié)——抗原識別與提呈中扮演著重要的角色。免疫系統(tǒng)中的DC主要存在兩種功能狀態(tài):未成熟DC(immature DC,imDC)和成熟DC(mature DC, mDC),不同的成熟狀態(tài)決定了DC不同的功能特性,imDC具有很強的攝取和加工抗原的能力,并能夠通過其表面的趨化因子受體,通過血液和淋巴系統(tǒng)遷移入淋巴結和脾;imDC在攝取抗原和炎癥信號的刺激下轉變?yōu)閙DC,mDC抗原提呈能力明顯增強,高表達共刺激分子和T細胞區(qū)的趨化因子受體,并分泌大量的細胞因子,激活T細胞,觸發(fā)T細胞的增殖和分化。同時其分泌的炎性細胞因子和趨化因子能夠吸引和活化天然免疫細胞以形成免疫應答與調控的網絡。DC作為免疫系統(tǒng)中功能最強大的專職抗原提呈細胞(Antigen-presenting cells, APC),是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁,有關DC分化發(fā)育、功能調控機制的研究仍然有問題尚不明了,DC與疾病發(fā)生發(fā)展關系與治療的應用研究也有待于進一步深入探討與驗證。 作為獨立于基因組序列本身,以整個染色質組成及其動態(tài)調控為研究對象的表觀遺傳學(Epigenetics)成為了21世紀極為重要的生命學科之一。經歷從1842年至今的巨大發(fā)展,表觀遺傳學逐漸走向成熟,形成了以DNA甲基化、組蛋白修飾、能量依賴的染色質重塑、核小體的動態(tài)重組以及非編碼RNA研究為核心的主流生命科學學科。各種表觀遺傳學事件在不同層次的相互作用和整合,建立和維持了不同的基因表達模式,嚴格的控制著從受精卵到完整生命體的分化發(fā)育全過程,成熟體各種細胞表型的維持以及與外界環(huán)境相互作用所產生的應答和反應,從而在機體的整個生理條件下發(fā)揮著至關重要的調控作用。在組學背景下,利用芯片以及第二代測序技術,在全基因組水平系統(tǒng)全面的研究表觀遺傳修飾圖譜的表觀遺傳組學(Epigenome)也應運而生。系統(tǒng)、綜合地在全基因組水平上繪制細胞乃至各實體分化,發(fā)育的動態(tài)DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、non-coding RNA組,已經成為系統(tǒng)深入地研究生命發(fā)生本質和疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段。 近十年來,免疫學研究的發(fā)展突飛猛進,基礎免疫學、臨床免疫學和免疫學技術三大方面齊頭并進,同時免疫學與其他生命科學和醫(yī)學學科的交叉更加深入和廣泛,在組學時代的宏觀背景下,免疫組學也逐漸形成。同時伴隨著功能基因組學時代的浪潮,免疫組學與各種組學研究也開始相互融合,越來越多的免疫學家開始把各種組學研究運用到免疫模型中去解決免疫學的根本性科學問題。表觀遺傳組學也開始應用到免疫細胞分化發(fā)育,以及免疫相關疾病和血液腫瘤的研究中。T細胞、B細胞的全基因組DNA甲基化譜已經開始利用低分辨率的技術手段進行繪制,與此同時,通過染色質免疫共沉淀結合測序(ChIP-sequencing)繪制全基因組組蛋白修飾譜,也應用到免疫學研究中,國外幾個實驗室開展了CD4+T細胞分化過程中(naive, Th1, Th2,Th17, iTreg, and natural Treg (nTreg) cell)的組蛋白修飾譜研究,并結合基因表達譜來找尋組蛋白修飾在調控不同類型基因中的共同規(guī)律。關于DC分化、成熟及其功能的表觀遺傳調控研究才起步,大多數研究尚集中在對一些DC的功能性細胞因子產生的調控,如組蛋白甲基化修飾對IL-12的調控,以及HDAC11對IL-10的負調控作用等等,同時抗原提呈關鍵分子MHC II類分子及其調控因子CIITA在DC成熟和活化中也受到表觀因子的調控,但目前尚沒有從DC的分化和特異功能的角度來探討表觀修飾因子調控DC的標志性研究。 表觀遺傳學通過對染色質狀態(tài)的調控,控制著細胞特異性基因群體在特定的時間和空間的開啟與關閉。特定的細胞群體,在外界信號的作用下,或者在分化發(fā)育過程中,建立起自身獨特性的DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜以及非編碼RNA組,通過這些表觀調控因子在全基因組范圍內的整合和相互作用,建立起組織和細胞特異性的表觀遺傳組,而反過來表觀遺傳組又能夠建立細胞特異性的轉錄組,從而使特定細胞群體獲得其特異的功能狀態(tài),從而建立了out-in-out的調控模式,決定了細胞的分化發(fā)育命運。 從表觀遺傳學的觀點,單一的細胞群體,特別是人的原代細胞的特異性表觀遺傳組圖譜,會具有怎樣的典型特征呢? DNA甲基化譜、組蛋白修飾組、非編碼RNA組以及染色質重塑復合體,在人的原代細胞的分化發(fā)育過程中,又是如何相互作用和相互影響,在DNA、組蛋白以及與其相結合的RNA和蛋白質的各個層次和三維空間中,建立起細胞特有的表觀遺傳組的呢? 從特定免疫細胞群體,如樹突狀細胞(DC)等出發(fā),哺乳動物,特別是人的血液系統(tǒng)和免疫器官中特定原代免疫細胞,在特定的信號,如細胞因子作用和感染刺激的誘導下,是如何通過外界信號的傳遞,從胞外-胞膜-胞漿-胞核,由外而內的傳遞DC分化成熟信號,通過外界信號活化和誘導的轉錄因子,非編碼RNA等建立起信號特異性的動態(tài)的特征性表觀遺傳組?再從胞核-胞漿-胞膜-胞外,由內而外的,通過表觀遺傳因子的特異性調控,決定關鍵基因的開啟與關閉,從而建立起未成熟DC(imDC)、成熟DC(mDC)的特異性功能特征,如抗原攝取、加工、提呈能力的差異性調控,DC特異性細胞因子和抗菌分子的分泌? 基于以上研究進展和現狀分析,針對以上科學問題的思考,我們利用深度測序技術,以表觀遺傳組學為研究手段,深入研究了人單核細胞,以及由其體外分化而來的人未成熟DC與成熟DC的動態(tài)的、以單個核苷酸為分辨率的全基因組DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、表達譜以及小RNA組,系統(tǒng)闡述了新鮮分離純化的人免疫細胞群體的特征性表觀遺傳組,以及各表觀調控因子之間的相互關系,并通過尋找DC分化成熟過程中的差異表觀修飾位點,來進一步揭示炎癥信號如何通過由外到內的傳遞,特異性的介導表觀修飾的改變,而又通過這些表觀修飾來影響關鍵基因,如轉錄因子的表達,從而使DC具備了其特異性的功能狀態(tài),由此建立了特異性信號誘導——差異表觀修飾位點——關鍵基因表達改變的研究思路,為尋找調控DC分化發(fā)育的關鍵分子,特別是核內的調控因子奠定了實驗基礎。 同時,考慮到專職定位于核內的小RNA的研究目前尚是空白,我們通過小鼠成熟DC(mDC)胞漿、胞核小RNA組的建立,從另一個表觀遺傳調控因子——非編碼小RNA的視角,來尋找和研究細胞核內的調控性小RNA的分布和序列特征,并結合DC的功能特點,初步探討了這些核內小RNA是如何特異性地靶向關鍵基因的調控區(qū)域,來介導表觀修飾的改變,從而控制DC特異功能基因的開啟和關閉的。 一.人單核細胞及樹突狀細胞分化成熟的動態(tài)表觀遺傳組學圖譜的建立和表觀調控機制的初步研究 為了應用表觀遺傳組學的技術手段來分析人DC分化成熟的表觀調控機制,我們分離了單個正常人的CD14+單核細胞,并體外誘導分化為imDCs,并進一步用LPS刺激imDCs,誘導其成為mDCs。提取這三種細胞的DNA、RNA以及以組蛋白修飾為研究對象,進行ChIP實驗,獲得ChIP-DNA,將所得產物進行DNA甲基化譜測序、表達譜測序、小RNA組測序、ChIP-seq,建立了三種細胞的以單個核苷酸為分辨率的DNA甲基化譜、組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3的全基因組修飾譜、基因表達差異的表達譜、小RNA表達差異的小RNA組,將這些數據進行整合研究,發(fā)現三種細胞中全基因組DNA甲基化主要以CG為背景的C的甲基化為主,占99%以上,同時三種細胞的甲基化率均一性較強,80%以上的以CG為背景的甲基化的C(mCG)的甲基化率均在90%以上,同時在monocyte分化為imDC的過程中,發(fā)生了廣泛的DNA去甲基化。組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3在全基因組的分布分析顯示,二者在基因的CDS區(qū)較少富集,同時我們發(fā)現H3K4me3和H3K27me3共修飾的區(qū)域其DNA甲基化率明顯低于H3K4me3和H3K27me3單獨富集的區(qū)域,在單核細胞中尤為明顯。這可能也反映了H3K4me3和H3K27me3共修飾的區(qū)域,通過DNA的低甲基化保持了可誘導活化或抑制的調控潛能。通過進一步分析基因組各元件的DNA甲基化特征,我們發(fā)現CG的密度與甲基化率存在負相關,CG高密度區(qū)的DNA甲基化率較低。同時不同的基因組元件也有其各自的DNA甲基化分布模式。 單細胞分析基因表達量與DNA甲基化和組蛋白修飾的關系,我們發(fā)現高表達的基因其啟動子區(qū)的DNA甲基化率較低,但在其轉錄區(qū),特別是第一個intron之后的轉錄區(qū),其DNA甲基化與基因表達是正相關的。而遠端的啟動子區(qū),也能觀察到DNA甲基化與表達量的正相關關系。而microRNA表達豐度與DNA甲基化的關系,卻有不同,microRNA轉錄區(qū)的DNA甲基化是明顯地高甲基化對應低表達,這說明了microRNA和蛋白編碼基因的DNA甲基化調控模式是不同的。同時組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3主要集中在TSS附近,H3K4me3富集于高表達基因,而H3K27me3富集于低表達基因,說明了二者對于基因表達的不同調控作用。 我們進一步分析了基因表達和表觀修飾在三種細胞中的動態(tài)變化特征,基因表達的雷達圖分析表明,DC分化成熟時,伴隨著廣泛的基因表達變化,說明了三種細胞不同的功能狀態(tài),從蛋白編碼基因表達變化圖中可以看出,在monocyte-imDC-mDC分化成熟過程中,先升高后降低的變化基因較少,也說明了DC和單核細胞在基因表達和功能上的異質性。而microRNA的表達差異分析表明,表達量顯著降低的microRNA較多,也反映了單核細胞分化為DC的過程中,通過下調microRNA來解除對一些基因表達的抑制,從而獲得更多的功能。PCA分析表明,DNA甲基化相對于組蛋白修飾和microRNA,在三種細胞中是比較穩(wěn)定的。通過DC功能相關pathways的基因啟動子區(qū)的DNA甲基化分析表明,這些pathways中大多數基因在單核細胞分化為imDC時發(fā)生了DNA的去甲基化,為這些基因的高表達或后期的激活做好準備。通過DNA甲基化和組蛋白修飾以及microRNA的聚類分析發(fā)現,DNA甲基化和組蛋白H3K27me3的動態(tài)變化呈現相同的變化趨勢,特別是對于H3K27me3高富集的區(qū)域,說明了二者的共調控關系。 DNA甲基化在單核細胞分化為imDC的過程中略微降低,但在imDC成熟時,DNA甲基化從整體水平上看較為穩(wěn)定,那么DNA甲基化是如何參與調控DC成熟的呢?我們通過尋找imDC-mDC的差異甲基化區(qū)域(differential methylated regions, DMRs),發(fā)現DNA甲基化能夠調控一些轉錄因子。眾所周知,轉錄因子對于細胞的分化和功能狀態(tài)的調控是極其重要的。我們發(fā)現轉錄因子FLI1、HSF4和EGR1啟動子的特定區(qū)域,在DC成熟時,經歷了DNA甲基化水平的升高,而其表達卻顯著降低。我們進而以EGR1為研究對象,探討了EGR1在DC分化成熟中的功能,通過EGR1的ChIP-seq數據分析,發(fā)現EGR1在imDC中傾向于調控細胞表面分子的表達,通過慢病毒介導的gain-and-loss研究,發(fā)現EGR1能夠抑制CD86,CD48,CD58的表達,從而抑制DC的成熟,可見,為了促進CD86,CD48,CD58的表達而使DC更好地激活T細胞,促DC成熟信號可以通過調控DNA甲基化而抑制了EGR1的表達,從而促進了DC成熟及其T細胞激活功能。 二.小鼠成熟樹突狀細胞(mDC)核內小RNA組的建立、特征分析以及初步功能探討 隨著非編碼RNA研究的深入,非編碼小RNA的存在及功能越來越受到關注。siRNA作為植物中存在的內源性小RNA,能夠以全序列匹配的方式介導靶mRNA的降解,microRNA作為一種更加廣泛存在于動植物中的非編碼小RNA,以部分序列匹配的方式參與細胞內mRNA的降解和翻譯的抑制。siRNA在植物中能夠介導基因轉錄水平的表觀調控,如介導基因啟動子區(qū)的DNA甲基化的修飾,但哺乳動物中現今并沒有找到一類介導表觀調控的小RNA,基于此,我們以小鼠mDC為細胞模型來尋找哺乳動物中是否存在一類主要定位于核內,專職介導基因轉錄的表觀調控的小RNA。我們分離mDC的胞漿、胞核兩個組分的RNA,進行小RNA測序研究,發(fā)現細胞核內的小RNA組的組分和特征有別于胞漿小RNA組,來源于重復序列,核小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)的小RNA主要定位于核內,而microRNA則主要定位在細胞漿中,同時核內的小RNA的長度分布也并不類似于胞漿中以22nt為主的分布,富集于核內的小RNA的5`端以A、T為主,3`端為C的比例較低,而在20-23nt的small RNAs中,較多以G結尾。我們將主要富集于核內的小RNA命名為nlsRNA(nulear localized small RNA),這類RNA產生部分依賴于Dicer酶的加工,但他們都不與AGO家族的蛋白相結合。 基于這類nlsRNA可能通過與啟動子部分匹配的模式來介導基因轉錄的表觀調控,我們分析了Dicer不依賴的nlsRNAs中表達量最高的一個nlsRNA,即nlsR-3的seed sequence與小鼠基因啟動子區(qū)的互補位點,發(fā)現nlsR-3能夠特異性靶向小鼠iNOS啟動子區(qū)的關鍵調控區(qū)域,同時通過其模擬物過表達和抑制物干擾等手段,發(fā)現其能夠抑制LPS誘導的iNOS的轉錄。進一步研究其對iNOS表達的調控機制,發(fā)現nlsR-3能夠介導染色質重塑抑制蛋白Mi-2β特異性靶向iNOS的啟動子區(qū),抑制iNOS的表達,同時能夠增加抑制性組蛋白修飾H3K27me3在iNOS啟動子區(qū)的產生來抑制iNOS的表達,并通過二者維持細胞靜息狀態(tài)下iNOS啟動子區(qū)的染色質關閉狀態(tài)。 綜上所述,我們通過大規(guī)模測序建立了人DC分化成熟的DNA甲基化譜、組蛋白修飾譜、mRNA表達譜和小RNA組,以及小鼠mDC的核小RNA組,以表觀遺傳組學的角度從面、線、點較深入地研究了表觀調控因子如何通過特異性調控DC功能相關的關鍵分子的表達來調控DC的分化成熟。我們系統(tǒng)分析了人DC分化成熟過程中的差異表觀修飾位點和差異表達基因,發(fā)現了DC成熟過程中受DNA甲基化調控的關鍵轉錄因子。通過核質分離小鼠mDC的小RNA,并結合高通量測序,我們發(fā)現了一群新的定位于核內的小RNA,并初步探討了其介導表觀修飾酶特異性靶向DC功能相關基因的啟動子區(qū),調控基因轉錄的新機制。大量組學數據的獲得,為關于DC的表觀調控研究提供了特異性信息分析數據平臺,也為在染色質水平干預DC功能,以及以表觀調控為視角來提高DC疫苗效率、設計新的免疫治療調控靶點和藥物靶標提供了線索和新的研究方向。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【引證文獻】

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1 任松葉;人類及酵母基因組功能區(qū)的核小體定位預測[D];內蒙古科技大學;2012年

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本文編號：1403172