發(fā)布時間：2018-01-09 23:13

  本文關(guān)鍵詞：腸道病毒71型3D重組病毒的拯救　出處：《山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)》2017年08期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的利用反向遺傳技術(shù)將腸道病毒71型(EV71)弱毒株SDLY1的3D蛋白置換入強毒株SDLY107,拯救重組病毒,為EV71 3D蛋白的研究提供操作平臺。方法利用重疊PCR的方法得到3D編碼區(qū)的重組片段,T-A克隆插入p MDl9-T載體。通過雙酶切、T4連接將其置換到含有SDLY107株全長的質(zhì)粒p MD19-T-107中。體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性RNA,轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞,盲傳3代得到重組病毒SDLY 107(1-3D),通過PCR和q RT-PCR對重組病毒進(jìn)行鑒定。結(jié)果 PCR擴(kuò)增得到大小為600、1 400和200 bp的3D區(qū)及其左右片段;重疊PCR擴(kuò)增得到大小為2 100 bp的1-3D片段;雙酶切鑒定重組質(zhì)粒得到大小為7 400和2 700 bp的片段,測序結(jié)果證實3D區(qū)置換成功;感染性RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后,接種至第3代時觀察到細(xì)胞皺縮變圓,折光性增強;PCR鑒定重組病毒得到大小為226 bp的片段;q RT-PCR檢測到細(xì)胞中病毒量于24 h開始緩慢增加,48 h后快速增多,至72 h后病毒量不再增長。結(jié)論成功拯救了重組病毒SDLY107(1-3D),為進(jìn)一步研究3D蛋白的毒力和其在EV71致病機制中的作用提供基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to replace the 3D protein of attenuated enterovirus 71 strain EV71 into the virulent strain SDLY107 by reverse genetic technique to save the recombinant virus. Methods the recombinant fragment of 3D coding region was cloned and inserted into p MDl9-T vector by using overlapping PCR. T4 ligation was inserted into the plasmid p MD19-T-107 containing the full length of SDLY107 strain. Infectious RNAs were obtained by transcription in vitro and transfected into Vero cells. The recombinant virus was identified by PCR and Q RT-PCR. The result of PCR amplification was 600. 3D region of 1 400 BP and 200 BP and its left and right fragments; A 1-3D fragment of 2100bp was amplified by overlapping PCR. The fragments of 7 400 BP and 2 700 BP were identified by double enzyme digestion. The results of sequencing confirmed that 3D region replacement was successful. After transfection of Vero cells with infectious RNA, it was observed that the cells were crumpled and rounded at the third passage, and the refraction was enhanced. A 226bp fragment of the recombinant virus was identified by PCR. Q RT-PCR detected that the amount of virus in the cells began to increase slowly at 24 h and then increased rapidly after 48 h. Conclusion the recombinant virus SDLY107 (1-3D) was successfully saved. It provides a basis for further studying the virulence of 3D protein and its role in the pathogenesis of EV71.
【作者單位】： 山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院病毒學(xué)研究室;山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心微生物室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金面上項目(81371833) 山東省重點研發(fā)計劃(2015GSF118162)
【分類號】：R373
【正文快照】： 腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原體之一,主要感染5歲以下的嬰幼兒[1],其臨床表現(xiàn)輕重不一,輕者僅表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足及口腔等處的斑丘疹和皰疹等,嚴(yán)重者可伴發(fā)無菌性腦膜炎、腦脊髓炎和神經(jīng)源性肺水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)并

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本文編號：1402905