本文關(guān)鍵詞：抑制體外擴(kuò)增小鼠造血干細(xì)胞衰老維持干性：下調(diào)異常激活的mTORC1信號(hào)　出處：《華中科技大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分mTORCl在造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中的活化規(guī)律 目的：mTORCl掌控了細(xì)胞多種生命過程,研究表明過高的mTORCl活性會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)壞境平衡。本研究的目的是探討造血干細(xì)胞在體外擴(kuò)增過程中,胞內(nèi)的mTORCl活性的變化規(guī)律。 方法：分選小鼠骨髓Lin-Sca-1+細(xì)胞,應(yīng)用無血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增分選的干祖細(xì)胞,應(yīng)用Rapamycin作為mTORCl抑制劑,以DMSO作為對(duì)照。擴(kuò)增10天,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集擴(kuò)增后細(xì)胞,流式檢測(cè)胞內(nèi)mTORCl底物p70 s6k磷酸化狀況。 結(jié)果：Lin-Sca-1+細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激下開始增殖,第6天時(shí)細(xì)胞擴(kuò)增了25±4.5倍,到了第10天時(shí),細(xì)胞擴(kuò)增了82±5.2倍。磷酸化p70 s6k的表達(dá)與之相應(yīng)。在未擴(kuò)增初始的狀態(tài)下,只有5.82±3.12%的細(xì)胞表達(dá)磷酸化p70 s6k,擴(kuò)增了6天以后,22.4±4.67%的細(xì)胞表達(dá)磷酸化p70 s6k,而擴(kuò)增了10天以后,73.4±5.23%的細(xì)胞表達(dá)磷酸化p70 s6k；在第6天的時(shí)候加入Rapamycin可以有效的抑制磷酸化p70s6k的表達(dá),但是并沒有完全抑制磷酸化p70 s6k的表達(dá)。 結(jié)論：mTORCl在10天的小鼠造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增過程當(dāng)中,前6天呈現(xiàn)一定水平的激活,在擴(kuò)增的第7-10天呈現(xiàn)一個(gè)劇烈激活的過程,這個(gè)過程和總細(xì)胞的大量擴(kuò)增相呼應(yīng)。 第二部分抑制mTORCl異�；钚源龠M(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增以及干性維持 目的：mTORCl過高活性會(huì)導(dǎo)致造血干細(xì)胞池的耗竭,而Rapamycin為m TORC1有效抑制劑。在上一部分的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)mTORCl在擴(kuò)增7-10天出現(xiàn)劇烈激活過程,本部分研究目的就是利用Rapamycin抑制mTORCl在小鼠造血干細(xì)胞擴(kuò)增第7-10天呈現(xiàn)的劇烈激活,研究其能否進(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增以及干性維持。 方法：分選小鼠骨髓Lin-Sca-1+細(xì)胞,應(yīng)用無血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增分選的干祖細(xì)胞,應(yīng)用Rapamycin作為mTORCl抑制劑,以DMSO作為對(duì)照。擴(kuò)增10天,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集擴(kuò)增后細(xì)胞。利用流式檢測(cè)細(xì)胞的表型,利用CAFCs (Cobblestone Area-Forming Cells)法檢測(cè)體外造血干細(xì)胞的功能,利用競(jìng)爭(zhēng)性移植的辦法檢測(cè)造血干細(xì)胞長(zhǎng)期造血能力。 結(jié)果：Rapamycin在第6天加入,在擴(kuò)增結(jié)束以后,會(huì)略微的減少有核細(xì)胞總的數(shù)量,Veh組總的有核細(xì)胞數(shù)量為2.73±0.33×105,而加Rapamycin組總的有核細(xì)胞數(shù)量為2.43±0.21×105。但是Rapamycin的加入?yún)s增高了LSK+細(xì)胞和Lin-Sca-1+細(xì)胞在總細(xì)胞中的比例,通過計(jì)算得出總的LSK+細(xì)胞和Lin-Sca-1+細(xì)胞的數(shù)量,我們發(fā)現(xiàn),Rapamycin相較于Veh可以顯著的增加LSK+細(xì)胞和Lin-Sca-1+細(xì)胞的數(shù)量,Veh組分別得到1.27±0.47×104和7.34±3.0×103的Lin-Sca-1+細(xì)胞和LSK+細(xì)胞,而Rapamycin組則得到1.97±0.56×104和10.64±3.42×103的Lin-Sca-1+細(xì)胞和LSK+細(xì)胞。當(dāng)與初始的Lin-Sca-1+細(xì)胞比較,計(jì)算Lin-Sca-1+細(xì)胞擴(kuò)增的倍數(shù)時(shí),Veh組獲得了4.2倍的擴(kuò)增,而Rapamycin獲得了6.5倍的擴(kuò)增。Rapamycin相較于Veh獲得了1.5倍的Lin-Sca-1+細(xì)胞數(shù)量。Rapamycin可以明顯的增加day14-CAFCs和day35-CAFCs,可以獲得150.67±16.4和9.26±1.45/100,000細(xì)胞的dayl4-CAFCs和day35-CAFCs,而Veh則只能獲得97.3±7.6和3.53±1.02/100,000細(xì)胞的day14-CAFCs和day35-CAFCs.當(dāng)計(jì)算day35-CAFCs擴(kuò)增倍數(shù)時(shí),即相當(dāng)于計(jì)算體外造血干細(xì)胞功能時(shí),Veh獲得了0.73±0.08倍的擴(kuò)增,而Rapamycin獲得了1.95±0.25倍的擴(kuò)增。Rapamycin擴(kuò)增后的細(xì)胞相較于Veh擴(kuò)增后的細(xì)胞在第8周的時(shí)候,能更有效的植入照射模型的小鼠體內(nèi)Rapamycin組CD45.2細(xì)胞的植入率為32.23±10.7%,Veh組的植入率為18.16±9.32%；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)至32周,Veh組的植入率有所降低,9.93±8.25%,而Rapamycin組的植入率為42.1±11.2%。 結(jié)論：Rapamycin能夠促進(jìn)體外造血干細(xì)胞的擴(kuò)增,并且增強(qiáng)擴(kuò)增后細(xì)胞造血重建的速度和長(zhǎng)期造血重建功能,維持其干性。 第三部分抑制mTORCl異常活性促進(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增的機(jī)制探討 目的：雖然明確了抑制mTORC1異�；钚钥梢源龠M(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增以及干性維持,但是其機(jī)制尚不清楚。在其他細(xì)胞環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)mTORCl活性與干細(xì)胞的凋亡,分化,衰老密切相關(guān),本研究的目的是探討抑制mTORCl活性促進(jìn)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增及干性維持的機(jī)制。 方法：分選小鼠骨髓Lin-Sca-1+細(xì)胞,應(yīng)用無血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增分選的干祖細(xì)胞,應(yīng)用Rapamycin作為mTORCl抑制劑,以DMSO作為對(duì)照。擴(kuò)增10天,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集擴(kuò)增后細(xì)胞。利用流式,免疫熒光,細(xì)胞組織化學(xué),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)細(xì)胞的周期,衰老等相關(guān)分子表達(dá)。 結(jié)果：通過Annexin-V對(duì)凋亡細(xì)胞的標(biāo)記,我們發(fā)現(xiàn)Veh組的總細(xì)胞Annex in-V表達(dá)率為8.93±1.5%,Rapamycin組的總細(xì)胞Annexin-V表達(dá)率為11.79±3.7%；在LSK+的細(xì)胞群體當(dāng)中,Annexin-V表達(dá)率在Veh組和Rapamycin組分別為2.61±0.57%和2±0.22%。通過CFCs (cloning forming cells)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Rapamycin對(duì)于粒-巨細(xì)胞形成集落,爆式紅細(xì)胞集落的生成沒有顯著的影響。對(duì)衰老表型的研究發(fā)現(xiàn),在未擴(kuò)增的對(duì)照的細(xì)胞中,我們幾乎沒有發(fā)現(xiàn)衰老的細(xì)胞,細(xì)胞在Veh的處理下,擴(kuò)增了10天以后,Lin-Sca-1+細(xì)胞出現(xiàn)了9.7±1.95%的衰老細(xì)胞,但是Rapamycin非常明顯的抑制了衰老細(xì)胞出現(xiàn)的頻率,為2.4±0.71%。對(duì)自噬的研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過Rapamycin處理以后,自噬標(biāo)志性分子LC3b的表達(dá)面積顯著低于Veh組,甚至比未擴(kuò)增的細(xì)胞還要低；對(duì)細(xì)胞周期的研究發(fā)現(xiàn),Rapamycin處理顯著的增加了G0期細(xì)胞的比例,Veh組的G0期細(xì)胞的比例為11.75±3.3%,Rapamycin組的G0期細(xì)胞的比例為21.7±3.5%。不僅如此,Rapamycin的處理還減低了p16和p53的表達(dá)。 結(jié)論：抑制mTORCl活性并沒有影響造血干細(xì)胞的凋亡和分化,而顯著降低了其在擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的衰老。Rapamycin并沒有通過增強(qiáng)自噬來抑制衰老,而是通過調(diào)節(jié)了一系列的細(xì)胞周期動(dòng)力因子和阻滯因子實(shí)現(xiàn)了對(duì)衰老的抑制。 第四部分mTORCl和p38 MAPKα在造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增過程中的相互對(duì)話關(guān)系 目的：在我們以前的研究中發(fā)現(xiàn)了抑制p38 MPKα的活性可以通過抑制衰老促進(jìn)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增,而在這里我們發(fā)現(xiàn)了抑制mTORCl的活性也是主要通過抑制衰老的作用而促進(jìn)了造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增,那么兩者的關(guān)系究竟如何呢?在這部分的研究當(dāng)中我們對(duì)mTORCl和p38 MAPKα相互對(duì)話關(guān)系進(jìn)行了深入的探討和研究。 方法：分選小鼠骨髓Lin-Sca-1+細(xì)胞,應(yīng)用無血清培養(yǎng)基添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增分選的干祖細(xì)胞,應(yīng)用Rapamycin作為mTORCl抑制劑,SB(SB203580)作為p38 MAPKα的抑制劑,以DMSO作為對(duì)照。擴(kuò)增10天,SB從第一天開始加,在第6天加入DMSO以及Rapamycin。10天以后,收集擴(kuò)增后細(xì)胞。通過免疫印跡,免疫熒光,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法檢測(cè)相關(guān)分子表達(dá)情況。 結(jié)果：在造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增過程當(dāng)中,抑制mTORCl對(duì)p38 MAPKα沒有影響,但是抑制p38 MAPKα活性會(huì)反而增強(qiáng)mTORCl的活性。聯(lián)合抑制mTORCl和p38 MAPKα可以進(jìn)一步促進(jìn)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。四組比較發(fā)現(xiàn),Veh組獲得了1.5±0.3×103,Rapamycin組獲得了1.9±0.1×103,SB組獲得了2.2±0.2×103,聯(lián)合處理組獲得了2.6±0.14×103的LSK+細(xì)胞,以及更多的day35 CAFCs,分別為3.4±0.57,7.8±0.32,9.7±0.21,11.4±0.63/100,000個(gè)擴(kuò)增細(xì)胞。聯(lián)合抑制mTORCl和p38 MAPKα,通過對(duì)SA-β-gal的研究發(fā)現(xiàn)SB和Rapamycin的聯(lián)合應(yīng)用明顯的進(jìn)一步降低了衰老表型的表達(dá),只有1.9±0.7%,而單獨(dú)加入Rapamycin或者SB則有4.3±2.1%,5.2±1.6%,聯(lián)合抑制以后p16和p53的表達(dá)進(jìn)一步降低,只有Veh組的0.37±0.05,0.45±0.08倍。 結(jié)論：在造血干細(xì)胞過程中抑制mTORCl對(duì)p38 MAPK a活性沒有影響,而抑制p38 MAPKα活性會(huì)進(jìn)一步激活mTORCl,同時(shí)抑制兩條通路可以通過增強(qiáng)抑制衰老達(dá)到進(jìn)一步促進(jìn)造血干細(xì)胞擴(kuò)增的目的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1400466