本文關(guān)鍵詞：人核糖核苷酸還原酶的質(zhì)子電子偶聯(lián)傳遞通路研究　出處：《浙江大學(xué)》2011年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：核糖核苷酸還原酶(RR)存在于所有的生物細(xì)胞中,其功能是將核糖核苷酸(NDPs)還原為脫氧核糖核苷酸(dNDPs),是DNA合成限速酶,其活性直接影響細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生發(fā)展,是抗腫瘤藥物的重要靶標(biāo)分子。RR結(jié)構(gòu)和功能研究為闡明其酶活性機(jī)制和研發(fā)靶向抗腫瘤藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。根據(jù)金屬輔助因子不同,RR可分為三類(lèi),而基于序列同源性和別構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制,第Ⅰ類(lèi)又可進(jìn)一步分為la, Ib, and Ic三個(gè)亞類(lèi),人、鼠和大腸桿菌等的RR屬于Ia亞類(lèi)。目前對(duì)Ia RR結(jié)構(gòu)和功能的研究主要是以大腸桿菌為模板,其中經(jīng)典模型認(rèn)為它是兩個(gè)R1大亞基和兩個(gè)R2小亞基組成的異四聚體。在大腸桿菌RR,存在著一條雙向的質(zhì)子電子偶聯(lián)傳遞通路,由R2上的·Tyrl22→Trp48→Tyr356和R1上的Tyr731→Tyr730→·Cys439組成,能夠?qū)⒆杂苫鶑腞2上的·Tyrl22傳遞到35?距離之外的R1的·Cys439上,為RR酶催化活性所必需。在R2參與電子傳遞的具有氧化還原活性的氨基酸殘基附近需要一個(gè)質(zhì)子傳遞媒介,從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)距離電子傳遞與短距離的質(zhì)子傳遞相偶聯(lián)。R2的Tyr356位于大、小亞基之間,Trp48與Tyr356以及R1之間的質(zhì)子電子偶聯(lián)傳遞機(jī)制長(zhǎng)期以來(lái)尚未闡明。 本課題以人RR小亞基M2(hRRM2)為研究模型,試圖找出Trp102(對(duì)應(yīng)大腸桿菌Trp48)和Tyr369(對(duì)應(yīng)大腸桿菌Tyr356)之間參與質(zhì)子電子偶聯(lián)傳遞的重要氨基酸位點(diǎn)。首先我們構(gòu)建了野生型和突變型hRRM2表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)原核表達(dá)和純化得到hRRM2蛋白,篩選獲得晶體,經(jīng)x線(xiàn)衍射解析得到hRRM2的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:30LJ;分辨率2.1?)。然后,根據(jù)我們解析的hRRM2晶體結(jié)構(gòu),將Trp102周?chē)??內(nèi)的6個(gè)氨基酸全部突變成丙氨酸。酶活性分析結(jié)果顯示,只有hRRM2突變體E106A的酶活性完全喪失。為了進(jìn)一步證明Elu106的重要性,我們將hRRM2的Elu106進(jìn)行多種類(lèi)型突變,結(jié)果顯示只有hRRM2突變體E106D具有10%的酶活性,而其余hRRM2突變體,如E106Q、E106A、E106R、E106K.E106L和E106Y的酶催化活性都完全喪失,進(jìn)一步證實(shí)了hRRM2的Elu106位點(diǎn)在RR酶催化中是必需的。 表面等離子體共振(SPR)研究結(jié)果顯示,hRRM2突變體E106D和E106Q不影響hRRMl和hRRM2的結(jié)合；x線(xiàn)衍射晶體結(jié)構(gòu)分析顯示,hRRM2突變體E106A、E106D和E106Q與野生型hRRM2的結(jié)構(gòu)差別微小,排除Elu106突變通過(guò)影響蛋白空間構(gòu)象而影響酶的催化活性；電子順磁共振(EPR)檢測(cè)顯示,hRRM2突變體E106A、E106D和E106Q也能形成雙鐵-酪氨酰自由基中心,并且強(qiáng)度與野生型蛋白一致,表明Elu106不參與酪氨酰自由基的形成。應(yīng)用RR自殺性抑制劑2-疊氮-2-脫氧-胞苷二磷酸(CzDP)實(shí)驗(yàn)證實(shí),hRRM2突變體E106A和E106Q中自由基傳遞通路是阻斷的,而hRRM2突變體E106D具有部分自由基傳遞的功能�；诘鞍拙w結(jié)構(gòu),構(gòu)建hRRM1和hRRM2全酶模型并進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析和理論計(jì)算表明,hRRM2的Elu106為hRR質(zhì)子電子偶聯(lián)傳遞通路關(guān)鍵位點(diǎn),其機(jī)制是作為hRRM2的Tyr369的質(zhì)子傳遞媒介參與酶活性必需的自由基傳遞。 以上研究首次發(fā)現(xiàn)Elu106是一個(gè)新的RR酶活性關(guān)鍵位點(diǎn),其機(jī)制是作為hRRM2質(zhì)子電子偶聯(lián)傳遞通路中的質(zhì)子受體／供體而為酶活性所必需。同時(shí),基于蛋白晶體結(jié)構(gòu),首次提出人RR的全酶結(jié)構(gòu)模型。這些結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步闡明RR酶分子的質(zhì)子電子偶聯(lián)傳遞機(jī)制具有重要意義,并為設(shè)計(jì)新的抗腫瘤藥物提供了RR結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Ribonucleotide reductase (RR) exists in all biological cells, and its function is the ribonucleotide reduction (NDPs) for deoxyribonucleic acid (dNDPs), DNA synthesis rate limiting enzyme, its activity directly affects the proliferation and tumor cell development, is an important target for molecular structure and function of.RR in order to elucidate the antitumor drugs the enzyme activity mechanism and research target and provide theoretical and experimental basis to anticancer drugs. According to the different metal cofactor, RR can be divided into three categories, and sequence homology and allosteric mechanism based on the first type can be further divided into La, Ib, and, Ic, three sub categories, and rats Escherichia coli RR belongs to the Ia subfamily. The current research on the structure and function of Ia RR was mainly Escherichia coli as the template, the classical model is that it is ISO four dimer two R1 subunit and two R2 subunits. In Escherichia coli RR, there exists a The two-way coupling of proton transfer pathway, composed of R2 - Tyrl22 - Trp48 - Tyr356 and R1 - Tyr730 - Tyr731 - Cys439, will be able to free radical transfer from R2 - Tyrl22 to 35? The distance R1 Cys439, is essential for the catalytic activity of RR enzyme in R2. Participate in electron transfer with a redox active amino acid residues near to a proton transfer medium, so as to realize the long distance and short distance transmission electron proton transfer coupled.R2 Tyr356 is located between the large, small subunit, proton electron pairs between Trp48 and Tyr356 and R1 combined transmission mechanism for a long time has not yet been elucidated.
In this paper RR small subunit M2 (hRRM2) model for the study, trying to find out the Trp102 (corresponding to Escherichia coli Trp48) and Tyr369 (corresponding to Escherichia coli Tyr356) in important amino acid sites of proton electron coupling transfer. Firstly, we construct the wild type and mutant hRRM2 expression plasmid, hRRM2 protein and purified by prokaryotic expression, screened crystals, the crystal structure of hRRM2 obtained by X-ray diffraction analysis (PDB:30LJ; resolution 2.1?). Then, according to the crystal structure of hRRM2 we analyzed, Trp102 around 5? 6 amino acids in all mutated to alanine. Enzyme activity analysis showed that only the enzymatic activity of hRRM2 mutant E106A completely lost. In order to further demonstrate the importance of Elu106, we will hRRM2 Elu106 for various types of mutations, results showed that the enzyme activity of mutant E106D hRRM2 only has 10%, while the remaining hRRM2 mutants, such as E106Q, The enzyme catalytic activity of E106A, E106R, E106K.E106L and E106Y is completely lost, which further confirms that the Elu106 site of hRRM2 is essential in the catalysis of RR enzyme.
Surface plasmon resonance (SPR) results showed that hRRM2 mutants E106D and E106Q did not affect the binding of hRRMl and hRRM2; X-ray diffraction analysis showed that the crystal structure of hRRM2 mutant E106A, E106D and E106Q and the differences in the structure of wild type hRRM2 small, excluding Elu106 mutation by affecting protein conformation and catalytic activity of the enzyme; electron spin magnetic resonance imaging (EPR) showed that hRRM2 mutants E106A, E106D and E106Q can form a double iron tyrosyl radical center, and the strength of the wild type protein, indicate the formation of Elu106 is not involved in the tyrosyl radical. The application of RR inhibitor Dutch act 2- azido -2- deoxy cytidine phosphate (CzDP two the experiment confirmed that the mutant E106A hRRM2) and E106Q free radical pathway is blocked, while the hRRM2 mutant E106D with partial free radical transfer function. Protein crystal structure based on the construction of hRRM1 and hRRM2 enzyme model Dynamic analysis and theoretical calculation show that hRRM2 Elu106 is the key site of hRR proton electron coupling pathway, and its mechanism is hRRM2 as the proton transport medium of Tyr369, which is involved in the free radical transfer of enzyme activity.
The above research discovered that Elu106 is a new RR enzyme activity of key sites, the mechanism is a hRRM2 proton electron coupling pathway in the proton acceptor / donor is required for enzyme activity. At the same time, based on protein crystal structure, first proposed the holoenzyme structure model of human RR. These results have important significance transfer mechanism to further elucidate the proton electron coupling RR enzyme molecule, and provide an experimental basis for the structure and function of RR antitumor new drug design.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1398024