本文關鍵詞：重組Toll樣受體7真核表達質粒的構建及其對髓樣樹突狀細胞免疫功能的影響　出處：《中國生物制品學雜志》2016年05期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的構建重組Toll樣受體7(Toll-ike receptor 7,TLR7)真核表達質粒,并分析其對髓樣樹突狀細胞(dendritic cell,DC)免疫功能的影響。方法用C57BL/6小鼠脾細胞制備原代DC,提取DC總RNA,以其逆轉錄合成的c DNA為模板擴增TLR7基因,克隆至載體pc DNA3.1(+)中,構建真核表達質粒pc DNA3.1-TLR7。經脂質體Lipofectamine2000將真核表達質粒轉染至小鼠DC,經G418篩選陽性克隆。分別采用Real-time PCR及Western blot法檢測轉染細胞中TLR7基因m RNA轉錄及蛋白的表達水平;同時采用流式細胞術及細胞因子試劑盒檢測轉染細胞表面共刺激分子CD80、CD86和MHCⅡ的表達及分泌白細胞介素-6(interleukins-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平。結果經PCR及雙酶切鑒定證明重組真核表達質粒pc DNA3.1-TLR7構建正確。轉染12、24、48及72 h的DC中均可見TLR7基因的轉錄及蛋白的表達,且48 h時的轉錄及表達水平最高。轉染48 h后,DC表面共刺激因子CD80、CD86和MHCⅡ的表達水平及其分泌IL-6和TNF-α的水平均顯著提高(P0.05)。結論成功建立了重組TLR7真核表達質粒,且其可明顯提高DC的免疫功能。
[Abstract]:Objective to construct a recombinant Toll like receptor 7 (Toll-ike receptor 7, TLR7) eukaryotic expression plasmid, and analysis of myeloid dendritic cells (dendritic, cell, DC) immune function. Methods C57BL/6 mice spleen cells were prepared from the primary DC, DC total RNA extraction, reverse transcriptase synthesis with its C DNA as template TLR7 gene was amplified and cloned into the vector PC DNA3.1 (+) and the eukaryotic expression plasmid PC was constructed by liposome DNA3.1-TLR7. Lipofectamine2000 eukaryotic expression plasmid was transfected into DC mice. The positive clones were selected by G418. The expression level of Real-time PCR and Western blot were used to assay TLR7 cells transfected with M gene transcription and protein RNA at the same time; using flow cytometry and cell ELISA Kit transfected cell surface costimulatory molecules CD80, CD86 and MHC II expression and secretion of interleukin -6 (interleukins-6, IL-6), tumor necrosis factor alpha (tumor necrosis fac Tor- alpha, alpha TNF-) level. The results by PCR and double enzyme digestion indicated that recombinant eukaryotic expression plasmid PC DNA3.1-TLR7 was constructed correctly. The expression of mRNA and protein were observed in TLR7 gene transfection of 12,24,48 and 72 h in DC, and 48 h transcription and expression of the highest level. After 48 h, DC the surface CO stimulatory factor CD80 expression level of CD86 and MHC II and the level of secretion of IL-6 and TNF- alpha were significantly increased (P0.05). Conclusion the recombinant eukaryotic expression plasmid of TLR7, and it can significantly improve the immune function of DC.

【作者單位】： 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院實驗動物研究中心;南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院腎內科;
【基金】：廣東省科技計劃項目(2014A030304024);廣東省科技計劃項目(2013B060300012) 南方醫(yī)院院長基金項目(201213006)
【分類號】：R392.12
【正文快照】： 樹突狀細胞(dendritic cell,DC)是體內功能最強大的抗原提呈細胞,主要依賴其表面的Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)識別病原微生物,是連接固有免疫應答和特異性免疫的橋梁[1]。TLR7是一種表達于細胞內涵體膜表面的跨膜信號轉導受體,可識別某些小分子的抗病毒化合物和病毒

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