本文關鍵詞：PGC-1a過表達在大鼠內耳血管紋邊緣細胞mtDNA4834缺失突變擬老化模型中意義的研究　出處：《華中科技大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的新生大鼠耳蝸血管紋邊緣細胞（Marginal cells，MCs）的體外原代培養(yǎng)及大鼠內耳血管紋邊緣細胞mtDNA4834缺失擬老化細胞模型的建立。 方法出生0-3天的新生SD大鼠斷頭后，在解剖顯微鏡下移去雙側顳骨，并取出耳蝸側壁血管紋組織。利用酶消化法制成細胞懸液后接種于細胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2/95%O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCs使用低濃度血清的動物上皮細胞培養(yǎng)基（Epithelial Cell Medium-animal），純化后細胞爬片，應用普通光鏡和免疫熒光的方法觀察、鑒定培養(yǎng)的細胞。將純化后的原代邊緣細胞用不同濃度梯度的D-半乳糖處理48小時，用CCK-8篩選出適宜濃度。在時間梯度組用篩選出的濃度處理純化后細胞，用熒光定量PCR的方法測定mtDNA4834相對缺失率，選取D-半乳糖的適宜作用時間用于后續(xù)實驗。用β-半乳糖苷酶染色試劑盒鑒定該濃度和時間D-半乳糖處理后MCs的衰老表型。 結果在普通光學顯微鏡下觀察到MCs接種24小時后貼壁生長，后期形成單層“鋪路石”樣外觀，細胞頂端可見分泌小泡，還可見由很多MCs形成的“dome”。采用低濃度血清培養(yǎng)基、差異性貼壁、選擇性消化三種方法能去除大部分成纖維細胞等雜細胞。免疫熒光檢測MCs表達角蛋白-18陽性。CCK-8檢測細胞活性發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖濃度為14mg/ml（p 0.05）和16mg/ml（p 0.01）時顯著抑制邊緣細胞活性，而濃度為12mg/ml（p0.05）時對邊緣細胞活性無明顯抑制作用，因此選擇12mg/ml D-半乳糖濃度處理邊緣細胞。在此濃度處理下，測定不同D-半乳糖作用時間組邊緣細胞mtDNA4834缺失突變率發(fā)現(xiàn)：120hr（p 0.05），168hr（p 0.01）and216hr（p 0.01）組的mtDNA4834缺失率與其各自時間的對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義。用β-半乳糖苷酶染色試劑盒鑒定，發(fā)現(xiàn)12mg/ml D-半乳糖作用120小時后的MCs呈衰老表型。 結論利用酶消化法可以成功的進行耳蝸血管紋邊緣細胞的原代培養(yǎng)，純化后可得到純度較高的MCs。用12mg/ml D-半乳糖作用MCs120小時后可以成功建立帶有mtDNA4834缺失突變的體外擬老化邊緣細胞模型。 目的研究轉錄因子PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1在離體的耳蝸血管紋邊緣細胞中的表達及分布情況。探討PGC-1a-GFP-Ad成功轉染離體血管紋邊緣細胞的條件。 方法用免疫熒光的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察PGC-1α，NRF-1，Tfam，NF-κB，F(xiàn)OXO-1和SIRT-1六個轉錄因子在離體的血管紋邊緣細胞中的表達情況及分布情況。用病毒滴度復核實驗和邊緣細胞感染預實驗復核PGC-1a-GFP Ad的病毒滴度，篩選適宜感染邊緣細胞的重組腺病毒的病毒滴度。 結果在離體邊緣細胞中，PGC-1α和NRF-1主要表達于細胞核；Tfam、FOXO-1和SIRT-1同時表達于細胞核和細胞質；NF-κB主要表達于細胞核，部分表達于細胞質。通過病毒滴度復核實驗和邊緣細胞感染預實驗篩選出適宜的感染邊緣細胞的重組腺病毒的病毒滴度是4×107PFU/ml。在激光共聚焦顯微鏡下觀察到被攜帶目的基因PGC-1α的重組腺病毒及空載腺病毒成功感染的邊緣細胞，由于表達了GFP蛋白，而呈現(xiàn)綠色熒光。 結論發(fā)現(xiàn)PGC-1α、NRF-1；Tfam；NF-κB；FOXO-1；SIRT-1六個轉錄因子在離體的血管紋邊緣細胞中都有表達及其分布情況。探討重組腺病毒感染體外邊緣細胞的最佳濃度，并轉染邊緣細胞成功。 目的研究PGC-1α在離體邊緣細胞mtDNA4834缺失突變擬老化模型中的作用及調節(jié)機制。 方法將離體邊緣細胞進行不同的處理后分四個實驗組：C組即未經(jīng)任何處理的空白對照組；G組即離體MCs經(jīng)12mg/ml D-半乳糖作用120hr誘導缺失擬老化模型組；B組即離體MCs轉染空載病毒后再經(jīng)12mg/ml D-半乳糖作用120hr誘導缺失擬老化模型組；P組即離體MCs過表達目的基因PGC-1α后再經(jīng)12mg/ml D-半乳糖作用120hr誘導缺失擬老化模型組。通過實時定量PCR檢測各組mtDNA4834缺失突變率。通過western blot檢測四組中PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1的蛋白表達水平的變化。通過β-半乳糖苷酶染色檢測各實驗組細胞的衰老情況。通過TUNEL檢測各實驗組細胞的凋亡情況。 結果通過檢測四組中mtDNA4834缺失突變率，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)造模組G和轉染空載病毒造模組B相比空白對照組，其缺失率增高有顯著意義（p 0.01），而過表達PGC-1α的P組普遍缺失率對比造摸組及轉染空載病毒的B組缺失率有明顯降低（p 0.01）。通過western blot檢測技術分別檢測四組中PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)在單純半乳糖造模組G組和轉染空載病毒組B組，上述轉錄因子的蛋白表達水平均升高。而在轉染PGC-1α目的基因后，P組可以檢測到明顯的PGC-1α蛋白水平的增高，對比B組有顯著統(tǒng)計學意義。對比B組NRF-1和Tfam蛋白表達增高有統(tǒng)計學意義，而NF-κB、FOXO-1和SIRT-1蛋白表達降低。檢測各組β-半乳糖苷酶及TUNEL的情況，發(fā)現(xiàn)單純半乳糖造模組G組和轉染空載病毒組B組對比對照組C，陽性表達的細胞增多，而P組對比B組，陽性表現(xiàn)細胞明顯減少。 結論PGC-1α目的基因在邊緣細胞中轉染成功，并過表達PGC-1α蛋白。而過表達PGC-1α在離體邊緣細胞擬老化模型中發(fā)揮保護作用，明顯降低了邊緣細胞因D-半乳糖誘導產(chǎn)生的mtDNA4834缺失突變，并且通過相關轉錄因子的作用，減輕邊緣細胞的老化和凋亡。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R764.436;R-332

【參考文獻】

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1 崔旭,李文彬,張炳烈,張潔,倪彬;D-半乳糖對神經(jīng)元和成纖維細胞擬老化作用的實驗研究[J];中國應用生理學雜志;1997年02期

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本文編號：1390896