本文關(guān)鍵詞：PGC-1a過表達在大鼠內(nèi)耳血管紋邊緣細(xì)胞mtDNA4834缺失突變擬老化模型中意義的研究　出處：《華中科技大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的新生大鼠耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞（Marginal cells，MCs）的體外原代培養(yǎng)及大鼠內(nèi)耳血管紋邊緣細(xì)胞mtDNA4834缺失擬老化細(xì)胞模型的建立。 方法出生0-3天的新生SD大鼠斷頭后，在解剖顯微鏡下移去雙側(cè)顳骨，并取出耳蝸側(cè)壁血管紋組織。利用酶消化法制成細(xì)胞懸液后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5%CO2/95%O2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCs使用低濃度血清的動物上皮細(xì)胞培養(yǎng)基（Epithelial Cell Medium-animal），純化后細(xì)胞爬片，應(yīng)用普通光鏡和免疫熒光的方法觀察、鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞。將純化后的原代邊緣細(xì)胞用不同濃度梯度的D-半乳糖處理48小時，用CCK-8篩選出適宜濃度。在時間梯度組用篩選出的濃度處理純化后細(xì)胞，用熒光定量PCR的方法測定mtDNA4834相對缺失率，選取D-半乳糖的適宜作用時間用于后續(xù)實驗。用β-半乳糖苷酶染色試劑盒鑒定該濃度和時間D-半乳糖處理后MCs的衰老表型。 結(jié)果在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到MCs接種24小時后貼壁生長，后期形成單層“鋪路石”樣外觀，細(xì)胞頂端可見分泌小泡，還可見由很多MCs形成的“dome”。采用低濃度血清培養(yǎng)基、差異性貼壁、選擇性消化三種方法能去除大部分成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞。免疫熒光檢測MCs表達角蛋白-18陽性。CCK-8檢測細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖濃度為14mg/ml（p 0.05）和16mg/ml（p 0.01）時顯著抑制邊緣細(xì)胞活性，而濃度為12mg/ml（p0.05）時對邊緣細(xì)胞活性無明顯抑制作用，因此選擇12mg/ml D-半乳糖濃度處理邊緣細(xì)胞。在此濃度處理下，測定不同D-半乳糖作用時間組邊緣細(xì)胞mtDNA4834缺失突變率發(fā)現(xiàn)：120hr（p 0.05），168hr（p 0.01）and216hr（p 0.01）組的mtDNA4834缺失率與其各自時間的對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。用β-半乳糖苷酶染色試劑盒鑒定，發(fā)現(xiàn)12mg/ml D-半乳糖作用120小時后的MCs呈衰老表型。 結(jié)論利用酶消化法可以成功的進行耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞的原代培養(yǎng)，純化后可得到純度較高的MCs。用12mg/ml D-半乳糖作用MCs120小時后可以成功建立帶有mtDNA4834缺失突變的體外擬老化邊緣細(xì)胞模型。 目的研究轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1在離體的耳蝸血管紋邊緣細(xì)胞中的表達及分布情況。探討PGC-1a-GFP-Ad成功轉(zhuǎn)染離體血管紋邊緣細(xì)胞的條件。 方法用免疫熒光的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察PGC-1α，NRF-1，Tfam，NF-κB，F(xiàn)OXO-1和SIRT-1六個轉(zhuǎn)錄因子在離體的血管紋邊緣細(xì)胞中的表達情況及分布情況。用病毒滴度復(fù)核實驗和邊緣細(xì)胞感染預(yù)實驗復(fù)核PGC-1a-GFP Ad的病毒滴度，篩選適宜感染邊緣細(xì)胞的重組腺病毒的病毒滴度。 結(jié)果在離體邊緣細(xì)胞中，PGC-1α和NRF-1主要表達于細(xì)胞核；Tfam、FOXO-1和SIRT-1同時表達于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)；NF-κB主要表達于細(xì)胞核，部分表達于細(xì)胞質(zhì)。通過病毒滴度復(fù)核實驗和邊緣細(xì)胞感染預(yù)實驗篩選出適宜的感染邊緣細(xì)胞的重組腺病毒的病毒滴度是4×107PFU/ml。在激光共聚焦顯微鏡下觀察到被攜帶目的基因PGC-1α的重組腺病毒及空載腺病毒成功感染的邊緣細(xì)胞，由于表達了GFP蛋白，而呈現(xiàn)綠色熒光。 結(jié)論發(fā)現(xiàn)PGC-1α、NRF-1；Tfam；NF-κB；FOXO-1；SIRT-1六個轉(zhuǎn)錄因子在離體的血管紋邊緣細(xì)胞中都有表達及其分布情況。探討重組腺病毒感染體外邊緣細(xì)胞的最佳濃度，并轉(zhuǎn)染邊緣細(xì)胞成功。 目的研究PGC-1α在離體邊緣細(xì)胞mtDNA4834缺失突變擬老化模型中的作用及調(diào)節(jié)機制。 方法將離體邊緣細(xì)胞進行不同的處理后分四個實驗組：C組即未經(jīng)任何處理的空白對照組；G組即離體MCs經(jīng)12mg/ml D-半乳糖作用120hr誘導(dǎo)缺失擬老化模型組；B組即離體MCs轉(zhuǎn)染空載病毒后再經(jīng)12mg/ml D-半乳糖作用120hr誘導(dǎo)缺失擬老化模型組；P組即離體MCs過表達目的基因PGC-1α后再經(jīng)12mg/ml D-半乳糖作用120hr誘導(dǎo)缺失擬老化模型組。通過實時定量PCR檢測各組mtDNA4834缺失突變率。通過western blot檢測四組中PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1的蛋白表達水平的變化。通過β-半乳糖苷酶染色檢測各實驗組細(xì)胞的衰老情況。通過TUNEL檢測各實驗組細(xì)胞的凋亡情況。 結(jié)果通過檢測四組中mtDNA4834缺失突變率，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)造模組G和轉(zhuǎn)染空載病毒造模組B相比空白對照組，其缺失率增高有顯著意義（p 0.01），而過表達PGC-1α的P組普遍缺失率對比造摸組及轉(zhuǎn)染空載病毒的B組缺失率有明顯降低（p 0.01）。通過western blot檢測技術(shù)分別檢測四組中PGC-1α、NRF-1、Tfam、NF-κB、FOXO-1和SIRT-1的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)在單純半乳糖造模組G組和轉(zhuǎn)染空載病毒組B組，上述轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達水平均升高。而在轉(zhuǎn)染PGC-1α目的基因后，P組可以檢測到明顯的PGC-1α蛋白水平的增高，對比B組有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。對比B組NRF-1和Tfam蛋白表達增高有統(tǒng)計學(xué)意義，而NF-κB、FOXO-1和SIRT-1蛋白表達降低。檢測各組β-半乳糖苷酶及TUNEL的情況，發(fā)現(xiàn)單純半乳糖造模組G組和轉(zhuǎn)染空載病毒組B組對比對照組C，陽性表達的細(xì)胞增多，而P組對比B組，陽性表現(xiàn)細(xì)胞明顯減少。 結(jié)論PGC-1α目的基因在邊緣細(xì)胞中轉(zhuǎn)染成功，并過表達PGC-1α蛋白。而過表達PGC-1α在離體邊緣細(xì)胞擬老化模型中發(fā)揮保護作用，明顯降低了邊緣細(xì)胞因D-半乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的mtDNA4834缺失突變，并且通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的作用，減輕邊緣細(xì)胞的老化和凋亡。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R764.436;R-332

【參考文獻】

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1 崔旭,李文彬,張炳烈,張潔,倪彬;D-半乳糖對神經(jīng)元和成纖維細(xì)胞擬老化作用的實驗研究[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;1997年02期

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本文編號：1390896