本文關(guān)鍵詞：基于胰島素的Ⅰ型糖尿病負(fù)調(diào)肽疫苗的研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：I型糖尿病(Type 1 diabetes,T1D)是由自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)的以胰腺β細(xì)胞損傷為主要特征的一種器官特異性自身免疫性疾病。無論在非肥胖糖尿病(nonobese diabetic,NOD)小鼠還是T1D患者,自身反應(yīng)性CD8~+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte)是T1D發(fā)病不可或缺的直接效應(yīng)細(xì)胞。針對(duì)β細(xì)胞自身反應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)行特異性的免疫干預(yù)與阻斷,重塑機(jī)體對(duì)β細(xì)胞自身抗原的免疫耐受,是一種可能從根本上預(yù)防T1D發(fā)生或發(fā)展的理想策略�？乖禺愋灾委熍c其他形式的治療方案相比,其優(yōu)勢(shì)在于無潛在的代謝活性并且能限制目的致病表位肽的反應(yīng)范圍。愈來愈多證據(jù)表明:負(fù)向調(diào)節(jié)疫苗是針對(duì)自身免疫性疾病治療的一種非常有效的抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑。它通常是根據(jù)天然表位肽人工修飾設(shè)計(jì)合成,能特異性下調(diào)致病自身反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)的拮抗型改造肽(altered peptide ligands, APL)。大量研究結(jié)果提示,反復(fù)給予天然肽或拮抗型表位改造肽可通過誘導(dǎo)自身反應(yīng)性CD8~+T細(xì)胞克隆無能或活化后凋亡(AICD)從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫耐受。 改造肽是在天然表位肽的基礎(chǔ)上對(duì)表位進(jìn)行氨基酸改造形成的具有更高穩(wěn)定性和免疫調(diào)節(jié)活性的短肽。目前常用的APL設(shè)計(jì)方法包括:1.TCR結(jié)合位點(diǎn)的替換;2.MHC-I類分子錨著殘基替換;3.殘基的特殊修飾,已成功應(yīng)用于其他自身免疫疾病如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)負(fù)調(diào)疫苗的治療研究中。 胰島素是啟動(dòng)T1D唯一所必需的關(guān)鍵靶抗原,胰島素特異性CD8~+T細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)是在T1D患者和NOD小鼠中最早浸潤(rùn)至胰島的CD8~+T細(xì)胞,它通過啟動(dòng)β細(xì)胞損傷,致使β細(xì)胞釋放大量危險(xiǎn)信號(hào)并暴露更多自身抗原,進(jìn)而通過表位擴(kuò)展,形成針對(duì)更廣泛自身抗原的“瀑布式”自身免疫反應(yīng)。因此,針對(duì)胰島素特異性CD8~+T細(xì)胞的免疫干預(yù),對(duì)于阻斷T1D的自身免疫啟動(dòng)顯得尤為關(guān)鍵�；谀軌蚰MT1D患者疾病過程的人源化HLA(human leucocyte antigen,人白細(xì)胞抗原)轉(zhuǎn)基因NOD小鼠模型(NOD.β2mnullHHD),已陸續(xù)鑒定了胰島素來源HLA-A*0201限制性CTL表位,其中胰島素A鏈2-10 (mInsA_(2-10))和胰島素B鏈5-14(mInsB_(5 14))與人胰島素序列高度同源,且具有交叉反應(yīng)性,為T1D的免疫干預(yù)以及將來的臨床轉(zhuǎn)化研究提供了良好的靶標(biāo)。 本研究根據(jù)自身抗原表位肽mInsA_(2-10)和mInsB_(5 14)設(shè)計(jì)計(jì)算得到若干APL,在多克隆T細(xì)胞動(dòng)物模型NOD.β2mnullHHD中篩選得到能下調(diào)肽特異性自身免疫性CD8~+T細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)的拮抗型APL,從而得到具有能預(yù)防、保護(hù)效應(yīng)的I型糖尿病負(fù)調(diào)疫苗。 本文第一部分,我們通過三方面實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述兩條已知自身抗原表位的自身反應(yīng)免疫原性。通過A2分子相對(duì)親和力實(shí)驗(yàn)證實(shí)該表位是HLA-A*0201限制性的,在人源化NOD小鼠T細(xì)胞功能水平通過CTL效應(yīng)細(xì)胞因子分泌檢測(cè)和CFSE增殖檢測(cè)證實(shí):其具備包含特異性分泌IFN-γ以及特異性增殖反應(yīng)等表位特異性自身反應(yīng)性。即mInsA_(2-10)、mInsB_(5 14)是具有優(yōu)勢(shì)免疫原性的HLA-A*0201限制性自身反應(yīng)性CD8~+T細(xì)胞表位。 第二部分,我們通過反復(fù)系統(tǒng)性給予可溶性抗原的方式分別將兩種自身抗原肽經(jīng)腹腔注射給予幼齡小鼠,觀察是否產(chǎn)生保護(hù)性預(yù)防T1D發(fā)生的作用。結(jié)果,給予可溶性mInsA_(2-10)并不能對(duì)人源化NOD小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用,反而加速了其T1D的疾病進(jìn)程以及增加發(fā)病率。mInsB_(5 14)處理組雖然能夠降低人源化NOD小鼠胰腺的病理?yè)p傷以并緩解淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)程度,以及降低分泌IFN-γ的CTL頻率,但對(duì)T1D發(fā)病率并沒有顯著的干預(yù)作用。 第三部分,我們首先利用InsightII工作站分別模擬構(gòu)建表位mInsA_(2-10)與HLA-A2分子的peptide-MHC三維復(fù)合體(mInsA_(2-10)-HLA-A2)。分別通過非天然氨基酸逐個(gè)替換的方法和TCR位點(diǎn)單個(gè)天然氨基酸的方法對(duì)mInsA_(2-10)與mInsB_(5 14)進(jìn)行改造,通過計(jì)算各候選APL與HLA分子結(jié)合能量變化、RMSD、以及氫鍵數(shù)量,初步篩選得到基于mInsA_(2-10)的4條APL與基于mInsB_(5 14)P6位點(diǎn)改造的6條APL作為候選APL用于后續(xù)生物功能的篩選。 通過與HLA-A2分子親和力檢測(cè)、CFSE染色增殖抑制能力分析以及IFN-γ分泌檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)鑒定候選APL中具有拮抗功能的APL。結(jié)果顯示,基于mInsA_(2-10)第4位點(diǎn)改為D型谷氨酸的mInsA_(2-10)D-Q4和第6位點(diǎn)改為D型半胱氨酸的mInsA_(2-10)D-C6為拮抗型APL,可以明顯下調(diào)靶器官胰島浸潤(rùn)自身反應(yīng)性CD8~+T細(xì)胞特異性分泌IFN-γ并抑制CD8~+T細(xì)胞在mInsA_(2-10)刺激下的增殖反應(yīng)。根據(jù)mInsB_(5 14)第6位由組氨酸改為苯丙氨酸的改造肽mInsB_(5 14)H6F也能顯著下調(diào)肽特異性外周自身反應(yīng)性CD8~+T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的應(yīng)答水平。 綜上,本研究在HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因NOD小鼠模型中驗(yàn)證了來自鼠胰島素的自身抗原表位mInsA_(2-10)和mInsB_(5 14)是HLA-A*0201限制性免疫優(yōu)勢(shì)自身反應(yīng)性CD8~+T細(xì)胞表位;發(fā)現(xiàn)通過腹腔注射方式反復(fù)給予T1D相關(guān)自身抗原CD8~+T細(xì)胞表位mInsA_(2-10)或mInsB_(5 14)并不能夠在該人源化NOD小鼠體內(nèi)產(chǎn)生預(yù)防T1D發(fā)生的保護(hù)效應(yīng);通過對(duì)mInsA_(2-10)與mInsB_(5 14)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助模擬氨基酸替換改造,并通過體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí):mInsA_(2-10)D-C6、mInsA_(2-10)D-Q4與mInsB_(5 14)H6F均為具有負(fù)調(diào)天然肽特異性CTL應(yīng)答功能的拮抗型APL,今后我們將在人源化NOD小鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證這三條拮抗型APL的治療效應(yīng),從而將這些肽用于抗T1D治療性疫苗研發(fā)的設(shè)計(jì)應(yīng)用當(dāng)中。本課題所建立的基于分子模擬、分子動(dòng)力學(xué)并結(jié)合自由能計(jì)算的計(jì)算機(jī)輔助APL設(shè)計(jì)平臺(tái)以及利用人源化疾病動(dòng)物模型的生物學(xué)功能篩選體系,可以極大的提高負(fù)調(diào)疫苗的研究效率。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R587.1;R392.1

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本文編號(hào)：1382940