本文關(guān)鍵詞：LP（a）對小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞損傷作用的初步研究　出處：《南華大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的：初步探討心血管疾病獨立危險因子脂蛋白（a）[LP（a）]對小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞（EPCs）的損傷作用及其可能的機制。 方法：實驗分為6組：①對照組，加等量含200μmol/L EDTA的全培養(yǎng)液；②1μg/ml的LP（a）處理組，③10μg/ml LP（a）處理組，④100μg/ml的LP（a）處理組，⑤300μg/ml LP（a）處理組，⑥600μg/ml LP（a）處理組。貼壁法分離與培養(yǎng)內(nèi)皮祖細胞（EPCs），攝取ac-LDL和結(jié)合UEA-1鑒定EPCs，MTT法檢測細胞存活與增殖，transwell測定細胞遷移，明膠粘附法測定EPCs的粘附，基質(zhì)膠上種植EPCs，photshop7.0計算血管長度，顯微鏡下觀測單個細胞克隆大小和克隆數(shù)目，RT-PCR和western blotting分別檢測一氧化氮合酶（eNOS）的mRNA水平和蛋白表達情況，細胞免疫組織化學技術(shù)檢測eNOS蛋白在EPCs的表達和分布情況，并采用DCFH-DA染色法檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）的量，采用Griess試劑法測定一氧化氮（NO）水平。 結(jié)果：①采用貼壁法能從小鼠鼠骨髓的單個核細胞中分離出純度達70%以上的EPCs。②LP（a）劑量依賴性影響EPCs存活，100μg/ml LP（a）開始對EPCs產(chǎn)生一定的破壞作用，300μg/ml LP（a）對EPCs的破壞作用急速加大。③1μg/mlLP（a）即能顯著抑制EPCs的遷移，當LP（a）濃度達到10μg/ml時，遷移到下槽的細胞數(shù)目大大減少，其遷移細胞數(shù)不到對照組的1/6，LP（a）濃度為100μg/ml時，其遷移細胞數(shù)減少到對照組的1/9，300μg/ml時其遷移細胞數(shù)約為對照組的1/14。④LP（a）劑量依賴性抑制EPCs的粘附。1μg/ml的LP（a）可明顯減少EPCs粘附細胞數(shù)目（145.2±8.4個/每個視野vs115.2±12.6個/每個視野，P＜0.05，n=5），當LP（a）的濃度達到10μg/ml時，EPCs粘附能力進一步下降，下降到對照組的1/2，當LP（a）的濃度達到100μg/ml時下降到對照組的約1/3，當LP（a）的濃度達到300μg/ml時，EPCs粘附能力下降最顯著，，其下降到對照組的約1/16。⑤EPCs經(jīng)10μg/ml LP（a）處理后，血管形成能力的明顯受到損傷，當LP（a）的濃度增加到100μg/ml時，EPCs的血管形成能力大大減弱，已經(jīng)不到對照組的1/4（36.34±1.54mm/每個視野vs8.76±0.62mm/每個視野，P＜0.001，n=5）；當LP（a）的濃度增加到300μg/ml時，差不多已經(jīng)見不到完整的血管樣結(jié)構(gòu)。⑥經(jīng)100μg/ml的LP（a）處理后，不但克隆數(shù)目明顯減少（10.2±1.3vs3.1±0.4，P＜0.01，n=5），而且克隆生長明顯受到抑制。⑦機制研究發(fā)現(xiàn)： EPCs經(jīng)過100μg/ml的LP（a）處理后， eNOS mRNA和蛋白表達均顯著下調(diào)，一氧化氮（NO）顯著減少（36.35±3.91vs3.91±0.79，P＜0.001，n=3）。活性氧檢測結(jié)果表明，在1μg/ml LP（a）作用下，活性氧產(chǎn)生顯著增加（1±0.12vs3.92±0.36，P＜0.05，n=5）；當LP（a）的濃度為10μg/ml時，熒光強度是對照組的近15倍；當LP（a）的濃度為100μg/ml時，與前述各組相比較，胞內(nèi)綠色熒光強度和發(fā)出綠色熒光的細胞均增多（圖12D），其熒光強度是對照組的31倍多，是1μg/mlLP（a）的近8倍，是10μg/ml LP（a）的2倍多。 結(jié)論： ①LP（a）濃度依賴性地抑制EPCs增殖； ②LP（a）濃度依賴性地抑制EPCs遷移； ③LP（a）濃度依賴性地抑制EPCs粘附； ④LP（a）濃度依賴性地抑制EPCs血管形成能力； ⑤LP（a）抑制EPCs的克隆形成； ⑥LP（a）對EPCs的損傷作用與抑制eNOS表達和NO生成有關(guān)，還與促進活性氧生成有關(guān)。
[Abstract]:Objective: to preliminarily explore the damage effect and possible mechanism of lipoprotein (a) [LP (a)] on the bone marrow derived endothelial progenitor cells (EPCs) of mice.
Methods: the experiment was divided into 6 groups: the control group, the medium with equal volume containing 200 mol/L EDTA; the 1 g/ml LP (a) treatment group, the 10 g/ml LP (a) treatment group, the 100 g/ml LP (a) treatment group, the 300 g/ml LP (a) treatment group, the 600 g/ml LP (a) treatment group. And cultured endothelial progenitor cells adherent (EPCs), uptake of ac-LDL and identification of EPCs combined with UEA-1, MTT method to detect cell survival and proliferation, Transwell determination of cell migration, adhesion assay of EPCs gelatin adhesion method, planting EPCs gel matrix photshop7.0, calculate the vessel length, the number of observations under a microscope single cell clone size and cloning, RT-PCR and Western blotting were used to detect the nitric oxide synthase (eNOS) expression levels of mRNA and protein, immunohistochemical detection of eNOS protein in the expression and distribution of EPCs, and DCFH-DA staining was used to detect the intracellular active oxygen method (ROS). Griess reagent method was used to determine the level of nitric oxide (NO).
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本文編號：1376766