發(fā)布時間：2018-01-03 10:30

  本文關鍵詞：甲型H1N1流感病毒血凝素基因的表達和免疫原性分析　出處：《揚州大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：流感病毒(influenza virus)是引起人類呼吸道感染及引起人類死亡的主要病因之一。人類曾多次遭受過流感病毒大流行(1918年H1N1亞型,1957年H2N2亞型,1968年H3N2亞型,1977年H1N1亞型)。至今人類仍然無法征服流感病毒�？焖贆z測及接種疫苗被認為是控制并清除流感病毒經(jīng)濟有效的手段。實時熒光定量PCR檢測流感病毒具有快速、特異性高的特點,但花費昂貴,不適合大面積推廣；當前使用的疫苗有流感減毒疫苗、滅活疫苗、裂解疫苗等,這些疫苗能夠在人體中產(chǎn)生保護性抗體,但是都有一定的缺陷,如減毒疫苗具有毒力回復的潛在性危險,而后兩種卻很難產(chǎn)生細胞免疫應答。因此,迫切需要研制一種快速的檢測流感病毒的方法及新型有效的疫苗。 當前發(fā)表的許多文章都證實了流感病毒糖蛋白抗原的保護性作用,在這些糖蛋白抗原中,血凝素(HA)的作用相當重要。HA具有免疫原性,抗血凝素抗體可以中和流感病毒,是主要的保護性抗原。因此,針對HA蛋白的重要性,以GenBank公布的A/California/05/2009H1N1流感病毒HA基因為目的基因,從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載HA基因序列,進行全基因合成,將人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到原核表達載體pET30a+上,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化Ecoli BL21(DE3),以IPTG對重組菌BL21(DE3)(pET-HA)進行誘導表達,表達產(chǎn)物His-HA融合蛋白通過變復性后純化。Western blot試驗結(jié)果表明表達產(chǎn)物His-HA融合蛋白能特異性地與人甲型H1N1流感患者陽性血清反應,證明表達產(chǎn)物His-HA融合蛋白具有免疫反應活性。利用該His-HA融合蛋白的建立檢測抗體的ELISA方法,并探究ELISA方法的最適宜條件,ELISA方法的適宜條件為原核表達產(chǎn)物His-HA融合蛋白以1μg/孔包板,檢測血清的稀釋度為1：80到1：640間；以建立的ELISA檢測300份人源血清樣品,陽性血清數(shù)量為74份,陽性率為24.67%,并與商品化試劑盒進行對比,符合率為98.65%,對比試驗說明建立的ELISA方法具有可行性。 將人工合成的甲型H1N1流感病毒的HA基因克隆到pFastBacl轉(zhuǎn)移載體,轉(zhuǎn)化DH5a,然后在含Kan抗生素的LB平板上挑取陽性菌落,得到的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac-HA,再提取陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含桿狀病毒穿梭載體Bacmid的受體菌E. coli DH10Bac中,發(fā)生轉(zhuǎn)座作用,在含慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素3種抗生素和X-gal/IPTG的LB培養(yǎng)板上,篩選出白色菌落得到重組穿梭載體Bacmid-HA.經(jīng)PCR鑒定為陽性后,采用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細胞獲得重組桿狀病毒,通過IFA、SDS-PAGE及Western blot試驗證實在Sf9細胞中HA蛋白得到表達。血凝試驗結(jié)果表明表達產(chǎn)物HA蛋白血凝價為1：16,血凝試驗證實真核表達產(chǎn)物具有生物活性。將真核表達的HA蛋白以100μg/只的劑量,通過皮下注射BALB/c小鼠,探討其免疫原性,ELISA檢測免疫小鼠血清的抗體效價,結(jié)果顯示,二免14天,HA蛋白免疫組的抗體效價與空白對照組之間呈現(xiàn)顯著差異(p0.05)。HA蛋白免疫小鼠血清血凝抑制試驗血凝抑制價為1:16。ELISPOT檢測免疫小鼠分泌細胞因子IL-4和IFN-γ脾臟淋巴細胞,結(jié)果顯示產(chǎn)生IFN-γ的分泌細胞少于產(chǎn)生IL-4的分泌細胞,Prism軟件包分析表明,兩者存在顯著差異(p0.05),免疫小鼠體內(nèi)趨向于Th-2為主的免疫應答。
[Abstract]:Influenza virus ( influenza virus ) is one of the leading causes of human respiratory tract infection and human death . The influenza virus ( H1N1 subtype in 1918 , H2N2 subtype 1957 , subtype H3N2 in 1968 , H1N1 subtype 1977 ) has been suffered many times . The rapid detection and inoculation of the vaccine is considered to be an effective means of controlling and removing influenza virus . The real - time fluorescence quantitative PCR detection of influenza virus has the characteristics of rapid and specific high specificity , but it is expensive and is not suitable for large - scale popularization ; the currently used vaccine has the potential danger of virulence recovery , and then the two are difficult to generate cellular immune response . Therefore , it is urgent to develop a rapid method for detecting influenza virus and a novel effective vaccine . coli BL21 ( DE3 ) was cloned into prokaryotic expression vector pET30a + . The recombinant shuttle vector Bacmid - HA was obtained by cloning the HA gene of artificially synthesized influenza A ( H1N1 ) virus into pFastBacl transfer vector , transforming DH5a , and then selecting positive colonies on LB plate containing Kan antibiotic . The results showed that HA protein had a significant difference ( P < 0.05 ) .

【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R373

【參考文獻】

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本文編號：1373517