本文關(guān)鍵詞：宿主細胞對人類冠狀病毒HCoV-229E天然免疫應答機制的研究　出處：《華東師范大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：天然免疫系統(tǒng)是宿主細胞抵抗病原體入侵的第一道屏障。然而,眾多研究發(fā)現(xiàn)血型Ⅱ型冠狀病毒——SARS冠狀病毒(SARS-CoV)和小鼠肝炎病毒(MHV)侵染細胞后不會激起或只能激起微弱的天然免疫反應,這有可能是這兩種病毒對宿主的高致病力的決定因素之一。進一步的研究提出了SARS冠狀病毒和小鼠肝炎病毒有可能采用兩種機制逃避宿主天然免疫,一種是逃避策略,兩種病毒都在宿主細胞的雙層膜小囊泡(DMVs)里復制,有可能使宿主天然免疫系統(tǒng)檢測不到病毒RNA。另一種策略是病毒本身編碼抑制天然免疫信號傳導的蛋白,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的此類蛋白有SARS和MHV的nsp1蛋白,木瓜類蛋白酶(PLP),核衣殼蛋白(N)等。 本工作中,我們研究了感染三種第1類冠狀病毒HCoV-229E, HCoV-NL63和TGEV后宿主細胞的天然免疫應答。我們發(fā)現(xiàn)三種病毒感染的細胞中都出現(xiàn)了IRF-3的磷酸化和二聚。但隨后的研究表明HCoV-229E和HCoV-NL63在IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平上以及翻譯水平的表達不盡相同,前者能顯著激活天然免疫應答并產(chǎn)生很高的IFN-p,后者卻只能激起很微弱的天然免疫反應。另外,干擾素預處理實驗表明干擾素對病毒復制的影響依賴于細胞類型,只在原代成纖維細胞中檢測到干擾素預處理對病毒復制的抑制,上皮細胞和癌細胞預處理IFN-p都未發(fā)現(xiàn)有明顯的這種抑制作用。 我們用MRC-5細胞以及LLC-MK2細胞分別感染HCoV-229E和HCoV-NL63,然后進行透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)被感染細胞內(nèi)都出現(xiàn)了大量的DMVs。由此,我們推斷雙層膜小囊泡結(jié)構(gòu)并不能阻止宿主天然免疫系統(tǒng)對病毒的識別。我們繼續(xù)深入研究了HCoV-229E與宿主細胞天然免疫系統(tǒng)的相互作用機制。我們構(gòu)建了HCoV-229E的全部基因的真核表達質(zhì)粒,同時構(gòu)建出兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,分別插入攜帶熒光素酶報告基因的IFN-p和IFN激發(fā)基因15(ISG15)的啟動子。用HCoV-229E的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后通過蛋白免疫印跡可以檢測到各蛋白的表達。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系同時用NDV或poly I:C激活細胞天然免疫的實驗表明所有基因中只有nsp1表達的蛋白能抑制IFN-β蛋白的生成以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中啟動子基因的表達。同時我們深入研究了SARS-CoV, HCoV-229E和HCoV-NL63的nsp1蛋白,發(fā)現(xiàn)它們在結(jié)構(gòu)和功能上都非常類似,并不是特異性地針對宿主天然免疫系統(tǒng),而是能阻止宿主細胞所有蛋白的合成,可能是所有冠狀病毒共有的致病因子之一。然而,和第二類冠狀病毒不同的是,我們并沒發(fā)現(xiàn)229E病毒能編碼任一特異性地針對宿主天然免疫系統(tǒng)的蛋白。這也是229E病毒能激活很強的天然免疫反應的主要原因。 上述結(jié)果表明nsp1蛋白以及DMVs在抑制宿主天然免疫上或許并未起到關(guān)鍵因子作用。HCoV-229E和所有其它冠狀病毒不同,它能激起強烈的天然免疫反應,同時致病力很弱,這些獨特性質(zhì)有望使其成為冠狀病毒通用的疫苗載體。
[Abstract]:However , it has been found that SARS coronavirus and hepatitis virus ( MHV ) can evade host innate immunity . One is the escape strategy . Two kinds of viruses are replicated in double - layer membrane vesicles ( DMVs ) of host cells . One strategy is that the virus itself encodes a protein that inhibits the transmission of natural immune signals . In the present work , we studied the innate immune response of host cells infected with three types of SARS - 1 coronavirus HCoV - 229E , HCoV - NL63 and TGEV . We found that both phosphorylation and dimerization of IRF - 3 occurred in three types of infected cells . However , the subsequent studies showed that HCoV - 229E and HCoV - NL63 could significantly activate the innate immune response and produce a very high IFN - p . We have studied the mechanism of interaction between HCoV - 229E and HCoV - NL63 . We have studied the interaction mechanism of HCoV - 229E and HCoV - NL63 . The above results suggest that nsp1 protein and DMVs may not play a key role in inhibiting host innate immunity . HCoV - 229E and all other coronavirus are different , which can stimulate strong innate immune responses , while pathogenic forces are weak , which are expected to make them a common vaccine vector for coronavirus .

【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

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