本文關鍵詞：HLA-A33分子的體外表達及鑒定　出處：《山東農(nóng)業(yè)大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：人類白細胞抗原(HLA)是一種重要的遺傳物質,是目前所知人體最復雜的多態(tài)系統(tǒng)。在我國人群中A33表位占A位點表位的21%,是臨床中較常見的表位。根據(jù)近些年相關報道,HLA-A33表位在多種疾病的病程進展過程中起著重要作用。在我國南方以及Korea統(tǒng)計的結果,HLA-A33與HBV感染后慢性化有較明顯的相關性;Luan-Yin Chang博士等的研究表明,HLA-A33型為EV71易感基因型;洪軍等人的研究表明,HLA-A33與小兒急性淋巴細胞白血病有遺傳相關性(曹海霞等2007)。 本研究通過構建HLA-A33表達載體,經(jīng)重組載體的鑒定、載體的轉化及轉染、目的蛋白的原核表達及表達水平的檢測,初步研究HLA-A33分子與EV71病毒分子之間的相互作用,為研究HLA-A33在相關疾病中的致病作用和免疫機制提供理論基礎和實驗依據(jù),本研究氛圍兩部分內(nèi)容。 第一部分:建立穩(wěn)定表達HLA-A33分子的細胞系及其功能的相關研究。從GenBank查閱人類HLA-A33的基因序列,結合真核表達的特點,優(yōu)化所得序列的密碼子,并且添加必要的限制性酶切位點Nhe I、Xho I及Flag標簽蛋白。通過四質粒慢病毒系統(tǒng)將目的基因片段整合到宿主細胞的基因組DNA上。構建的穩(wěn)定細胞系通過puro篩選可穩(wěn)定傳代的細胞,通過IF,WB,PCR等方法鑒定細胞系。用EV71病毒感染所獲得的穩(wěn)定細胞系,嘗試通過CoIP尋找HLA-A33與EV71之間存在相互作用的蛋白質。 第二部分:HLA-A33基因在原核細胞中表達及檢測。根據(jù)原核表達的特點重新優(yōu)化密碼子,選擇pET28a作為表達載體,在序列兩端添加Nco I和BamH I限制性酶切位點,通過T4連接酶將載體和序列連接,化學轉化法轉入大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞,得到大量克隆并用PCR和測序鑒定目的基因的插入情況。將重組質粒重新轉化入表達菌柱BL21(DE3),通過IPTG誘導表達,SDS-PAGE凝膠電泳,考馬斯亮藍成像來檢測HLA-A33蛋白在原核細胞內(nèi)表達情況。原核表達的蛋白添加了BirA酶底物肽和鏈親和素標簽Streptavidin,為后續(xù)構建HLA-A33分子的tetramer四聚體提供實驗基礎。 本實驗取得了如下成果:用常用的分子克隆技術成功構建了HLA-A33的原核表達載體,實現(xiàn)HLA-A33蛋白在原核細胞內(nèi)的高效表達,并對表達蛋白進行了檢測分析;利用慢病毒系統(tǒng)轉染法獲得了HLA-A33穩(wěn)定細胞系并利用穩(wěn)定細胞系初步進行EV71與HLA-A33相互作用蛋白的分析。實驗的成果對于HLA-A33的后續(xù)研究具有重要的理論意義并提供堅實的實驗基礎。
[Abstract]:Human leukocyte antigen ( HLA ) is an important genetic material , which is the most complex multi - state system known to the human body . According to the recent years , HLA - A33 epitopes play an important role in the course of disease progression . According to the recent years , HLA - A33 has a significant correlation with chronic disease after HBV infection . The study of Luan - Yin Chang et al . shows that HLA - A33 is a susceptible genotype of EV71 . Studies from Hongjun et al . show that HLA - A33 is genetically related to childhood acute lymphoblastic leukemia ( Cao Haixia et al 2007 ) . In this study , the interaction between HLA - A33 molecule and EV71 virus molecule was preliminarily studied by constructing HLA - A33 expression vector , identification of recombinant vector , transformation and transfection of vector , prokaryotic expression and expression level of target protein , and provided a theoretical basis and experimental basis for studying the pathogenic role and immune mechanism of HLA - A33 in related diseases . A stable cell line was constructed by puro screening for stably passaged cells , and the stable cell line obtained by using EV71 virus infection was used to search for the interaction between HLA - A33 and EV71 by CoIP . In the second part , the expression and detection of HLA - A33 gene in prokaryotic cells were studied . According to the characteristics of prokaryotic expression , the codons were re - optimized and pET28a was chosen as expression vector . The expression of HLA - A33 protein in prokaryotic cells was detected by means of T4 ligase . The expression of HLA - A33 protein in prokaryotic cells was detected by IPTG - induced expression , SDS - PAGE gel electrophoresis . In this experiment , the prokaryotic expression vector of HLA - A33 was successfully constructed by using conventional molecular cloning technology . The expression of HLA - A33 protein in prokaryotic cells was carried out . The HLA - A33 stable cell line was obtained by the transfection of lentivirus system and the interaction protein of EV71 and HLA - A33 was obtained by using stable cell line . The results of experiment were of great theoretical significance and provide a solid experimental basis for the subsequent study of HLA - A33 .

【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【參考文獻】

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4 李成濤;HLA基因分型技術的進展與展望[J];法醫(yī)學雜志;2004年02期

5 姜山;慢性病毒性肝炎與人類基因組相關性的研究進展[J];國外醫(yī)學(流行病學傳染病學分冊);2002年05期

6 江華;張海蓉;;人類白細胞抗原基因多態(tài)性研究及其在肝病中的應用[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2006年12期

7 邱福南;王耀東;賴智德;;肝腎聯(lián)合移植術后免疫抑制藥物使用經(jīng)驗——附1例肝腎聯(lián)合移植并脾切除術長期生存報告[J];海峽藥學;2006年05期

8 駱媛;袁方;孫玉英;金荔;梁飛;劉楠;宋新強;劉曙光;劉金鋒;王丹;薛紅;孔繁華;奚永志;;中國漢族人群人類白細胞抗原HLA不同基因座位間的基因重組[J];中國科學(C輯:生命科學);2007年04期

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3 謝毓濱;湖南漢族人群HLA-A、B、DRB1等位基因及單倍型多態(tài)性研究[D];中南大學;2007年

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本文編號：1371590