本文關(guān)鍵詞：人ORMDL3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 克隆人血清類黏蛋白1樣蛋白3(orosomucoid1-like protein3, ORMDL3)基因啟動(dòng)子并尋找其最小活性區(qū)域；鑒定調(diào)控ORMDL3基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；克隆和鑒定ORMDL3基因新剪接異構(gòu)體，，為闡明其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法： 采用5’端和3’端cDNA末端快速擴(kuò)增法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)確定ORMDL3基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及尋找新剪接異構(gòu)體。以HEK293細(xì)胞基因組DNA為模板，采用PCR方法獲取ORMDL3基因5’側(cè)翼序列及一系列5’端缺失體，定向插入pGL3-Basic載體。運(yùn)用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)鑒定其啟動(dòng)子活性并確定啟動(dòng)子最小活性區(qū)域。利用點(diǎn)突變技術(shù)、RNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)、染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecitation，ChIP)及Sequential ChIP等實(shí)驗(yàn)，鑒定調(diào)控ORMDL3基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。PCR擴(kuò)增出ORMDL3野生型及新剪接異構(gòu)體ORMDL3V1編碼序列(Coding Sequence, CDS)，定向插入pEGFP-C1載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別提取蛋白行Western blot分析了解它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)表達(dá)及熒光顯微鏡觀察它們的亞細(xì)胞定位。 結(jié)果： 在HEK293細(xì)胞中，5’-RACE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，它們位于翻譯起始密碼子ATG上游34到143bp位。將構(gòu)建的ORMDL3基因5’側(cè)翼序列(pGL-1318/+58)及一系列截短片段的重組報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293、HeLa和A549細(xì)胞，螢光素酶活性分析結(jié)果顯示：從-1316bp缺失到-84bp位后，仍具有較高的啟動(dòng)子活性，但當(dāng)缺失到-8bp位時(shí)，基本與陰性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Basic活性相當(dāng)，提示ORMDL3啟動(dòng)子最小活性區(qū)域位于-84～+58bp區(qū)域，而且在-84～-9bp區(qū)域之間存在重要的調(diào)控元件。生物信息學(xué)預(yù)測該區(qū)域包含了Ets-1，SRY，p300，WHNF，SP1(A，B)，AhR/Arnt，EIk-1，NRF-1和CREB結(jié)合位點(diǎn)，點(diǎn)突變結(jié)果表明Ets-1、 p300和CREB位點(diǎn)維持了ORMDL3的基本轉(zhuǎn)錄活性。RNA干擾、轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)、ChIP和SequentialChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ets-1、 p300和CREB轉(zhuǎn)錄因子能與ORMDL3的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合并正向調(diào)控ORMDL3的表達(dá)，其中Ets-1和p300在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起協(xié)同作用。在HeLa細(xì)胞中，通過5’-RACE和3’-RACE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了一種ORMDL3新的剪接異構(gòu)體ORMDL3V1。ORMDL3V1缺失野生型ORMDL3基因的第二外顯子，并有不同長度的3’非翻譯區(qū)(Untranslated Regions, UTR)。編碼產(chǎn)生一個(gè)與野生型相比氨基端缺失59個(gè)氨基酸的截短蛋白質(zhì)。RT-PCR結(jié)果顯示與野生型ORMDL3在多種組織和不同細(xì)胞系中的廣泛表達(dá)不同，ORMDL3V1在白細(xì)胞、脾臟、胸腺和HeLa細(xì)胞中表達(dá)高，在肝、結(jié)腸、腦、肺臟、腎臟、卵巢和睪丸中低表達(dá)，在骨骼肌、心臟、胰腺、前列腺和小腸中、HEK293細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、HL60細(xì)胞和子宮內(nèi)膜細(xì)胞未見表達(dá)。Western blot分析檢測到EGFP-ORMDL3融合蛋白和EGFP-ORMDL3V1融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，熒光顯微鏡觀察顯示ORMDL3和ORMDL3V1均定位于胞漿。 結(jié)論： 人ORMDL3基因的最小活性啟動(dòng)子區(qū)域位于-84至+58bp處，Ets-1、p300和CREB能夠正向調(diào)控ORMDL3的表達(dá)；鑒定了一種ORMDL3新剪接異構(gòu)體，它能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并和野生型ORMDL3一樣定位于胞漿。
[Abstract]:Objective:
Cloning of human orosomucoid 1 like protein 3 (orosomucoid1-like protein3 ORMDL3) gene promoter and to find out the minimal active region; identification of key transcription factors regulating ORMDL3 gene; cloning and identification of new ORMDL3 gene splicing isoforms, lay the foundation for clarifying the mechanism of transcriptional regulation.
Method錛

本文編號(hào)：1370663