本文關(guān)鍵詞：GDF-5誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞“自組裝”修復(fù)軟骨缺損的研究　出處：《華中科技大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分GDF-5促進(jìn)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化的研究 目的探討生長(zhǎng)分化因子5(GDF-5)誘導(dǎo)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone mesenchymal stem cells, BMSCs)成軟骨細(xì)胞分化的可行性及最佳誘導(dǎo)濃度。 方法采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面CD45,CD14,CD44,CD29和CD105表達(dá)。不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)成人BMSCs,采用油紅0和茜素紅染色檢測(cè)成脂,成骨分化情況。采用含0、10、50、100 ng/ml GDF-5的軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)BMSCs 21天,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化；RT-PCR檢測(cè)不同濃度GDF-5組細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan表達(dá)；免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá)；番紅0和阿里新藍(lán)染色檢測(cè)蛋白多糖表達(dá)。 結(jié)果成人BMSCs呈梭形漩渦狀生長(zhǎng),CD29、CD44、CD105表達(dá)陽(yáng)性,CD14、CD45呈陰性表達(dá),并具有向脂肪,骨等組織多向分化的潛能。GDF-5誘導(dǎo)7天后細(xì)胞形態(tài)逐漸由長(zhǎng)梭形向多邊形、多角形轉(zhuǎn)化。不同濃度GDF-5誘導(dǎo)21天,Ⅱ型膠原表達(dá)量各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；Aggrecan的表達(dá)CM組和10 ng組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其它各組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá)陽(yáng)性,阿里新藍(lán)和番紅0染色均為陽(yáng)性。 結(jié)論全骨髓培養(yǎng)法成功分離培養(yǎng)BMSCs,含100 ng/ml GDF-5軟骨誘導(dǎo)液能有效促進(jìn)成人BMSCs向軟骨表型分化。 第二部分GDF-5誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞“自組裝”構(gòu)建組織工程軟骨 目的探討以生長(zhǎng)分化因子5(GDF-5)誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs) "自組裝”(Self-Assembly)構(gòu)建組織工程化軟骨的可行性和最佳方法。 方法分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,取第4代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)分成四組：BMSCs消化后分別懸浮于軟骨誘導(dǎo)液中(CM1組)和含100 ng/ml GDF-5的軟骨誘導(dǎo)液中(D1組)自組裝培養(yǎng)6周；BMSCs先用含100 ng/ml GDF-5的軟骨誘導(dǎo)液在培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)3周消化后分別懸浮于軟骨誘導(dǎo)液中(CM2組)和含100 ng/ml GDF-5的軟骨誘導(dǎo)液(D2)中自組裝培養(yǎng)6周。分別對(duì)4組自組裝組織團(tuán)塊進(jìn)行大體觀察；HE染色觀察自組裝組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原表達(dá)、阿利新藍(lán)染色檢測(cè)組織蛋白多糖表達(dá)；采用生化分析組織團(tuán)塊GAG,總膠原,細(xì)胞數(shù)目變化。 結(jié)果四組自組裝組織團(tuán)塊均具有類似軟骨的外觀,其中相同細(xì)胞接種密度下,D2組形成組織團(tuán)塊直徑最大,含水量最高,具有更高的干重和濕重；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示D2組Ⅱ型膠原表達(dá)最強(qiáng),Ⅹ型膠原表達(dá)最弱；阿里新藍(lán)染色顯示D2組蛋白多糖含量最高；生化分析顯示自組裝培養(yǎng)6周,D2組具有更高的糖胺聚糖(GAG),總膠原含量,團(tuán)塊含有的細(xì)胞數(shù)目最多。 結(jié)論采用“自組裝”技術(shù)培養(yǎng)GDF-5誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠形成具有類似軟骨形態(tài),組織學(xué)和分子生物學(xué)特性的組織團(tuán)塊,GDF-5預(yù)誘導(dǎo)的BMSCs在GDF-5持續(xù)存在條件下,自組裝形成的組織團(tuán)塊更具有天然軟骨的特性。 第三部分“自組裝”工程化軟骨在裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)改建 目的應(yīng)用“自組裝”培養(yǎng)技術(shù)聯(lián)合生長(zhǎng)分化因子5 (growth differentiation factor5,GDF-5)體外構(gòu)建工程化軟骨,比較裸鼠體內(nèi)植入前后軟骨相關(guān)生物學(xué)特性的差異,探討“自組裝”工程化軟骨臨床應(yīng)用的可行性。 方法全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。將第4代BMSCs用含100 ng/ml GDF-5的軟骨誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)3周后重懸細(xì)胞,以1×107／ml的細(xì)胞終濃度接種于2%瓊脂糖包被的24孔板,行自組裝培養(yǎng),體外培養(yǎng)6周后部分標(biāo)本植入裸鼠皮下,再經(jīng)體內(nèi)6周后取材。通過(guò)大體觀察、糖胺聚糖含量(GAG)測(cè)定、組織學(xué)、免疫組化以及RT-PCR等方法對(duì)體內(nèi)植入前后標(biāo)本的軟骨相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行比較。 結(jié)果體外培養(yǎng)6周時(shí)預(yù)分化的BMSCs'“自組裝”形成了軟骨樣組織,但質(zhì)地較軟。體內(nèi)植入6周后,“自組裝”工程化軟骨能維持良好的軟骨外觀,GAG含量明顯高于體外標(biāo)本(P0.05),組織學(xué)可見(jiàn)成熟軟骨陷窩,免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示體內(nèi)標(biāo)本的異染基質(zhì)及Ⅱ型膠原顯色程度均明顯強(qiáng)于體外標(biāo)本。RT-PCR檢測(cè)Ⅱ型膠原和aggrecan mRNA呈陽(yáng)性表達(dá)。 結(jié)論應(yīng)用“自組裝”技術(shù)聯(lián)合GDF-5構(gòu)建的工程化軟骨在裸鼠體內(nèi)皮下環(huán)境中能維持良好的軟骨特性,并且體內(nèi)環(huán)境能促進(jìn)其生物學(xué)改建及進(jìn)一步發(fā)育成熟。 第四部分“自組裝”工程化軟骨體外修復(fù)人關(guān)節(jié)軟骨缺損 目的探討用生長(zhǎng)分化因子5(growth differentiation factor 5, GDF-5)誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone-derived marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)聯(lián)合“自組裝”(Self-assembly)技術(shù)構(gòu)建的工程化軟骨體外修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性及其轉(zhuǎn)歸。 方法全骨髓法分離培養(yǎng)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)。將第4代BMSCs用含100 ng/ml GDF-5的軟骨誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo),3周后用含生長(zhǎng)分化因子5的軟骨誘導(dǎo)液重懸細(xì)胞,以1×107/ml的細(xì)胞密度接種于2%瓊脂糖包被的24孔板,每孔400μ,行自組裝培養(yǎng),3周后對(duì)標(biāo)本行大體和組織學(xué)觀察并采用生物化學(xué)法檢測(cè)軟骨相關(guān)的生物學(xué)特性。然后將部分標(biāo)本植入到體外全層軟骨缺損模型內(nèi),培養(yǎng)3周觀察軟骨缺損的修復(fù)效果,并比較修復(fù)前與修復(fù)后標(biāo)本的軟骨相關(guān)生物學(xué)特性變化情況。 結(jié)果體外培養(yǎng)3周時(shí)預(yù)分化的BMSCs "自組裝”形成一軟骨樣組織,組織學(xué)檢測(cè)到軟骨特異性成分陽(yáng)性表達(dá)。全層軟骨缺損修復(fù)模型體外培養(yǎng)3周后,大體和組織學(xué)可見(jiàn)缺損由工程化軟骨所修復(fù),交界面發(fā)生整合,呈緊密連接狀,Ⅱ型膠原和蛋白多糖呈陽(yáng)性表達(dá),但弱于未移植組。同時(shí)檢測(cè)到Fibronectin在軟骨缺損修復(fù)模型內(nèi)的交界區(qū)有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。生化結(jié)果顯示移植組標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)、GAG和總膠原含量均低于未移植組(P0.05)。RT-PCR結(jié)果也反映出這一變化。 結(jié)論“自組裝”工程化軟骨能有效地修復(fù)體外關(guān)節(jié)軟骨缺損,并且能較穩(wěn)定地維持軟骨表型。
[Abstract]:Effect of GDF - 5 on chondrogenic differentiation of adult bone marrow mesenchymal stem cells Objective To investigate the feasibility and optimal concentration of growth differentiation factor 5 ( GDF - 5 ) in inducing differentiation of adult bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) into chondrocytes . Methods The bone marrow cells were isolated and cultured by full - bone marrow culture method . The expressions of CD29 and CD105 were detected by flow cytometry . The cells were induced by different induction culture medium . The expression of collagen and Aggrecan was observed by using oil red 0 and alizarin red staining . The expression of type 鈪，

本文編號(hào)：1368880