本文關鍵詞：肺炎嗜衣原體CPAFm-mAb的制備和沙眼衣原體L2在不同細胞內(nèi)的生長情況　出處：《南華大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:制備抗肺炎嗜衣原體(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease like activity factor,CPAF)免疫優(yōu)勢區(qū)(181～400aa,CPAFm)基因重組蛋白的單克隆抗體(mAb),并用此mAb建立ELISA方法,檢測臨床咽拭子標本,評價該mAb在Cpn早期感染診斷中的應用價值,為制備Cpn感染快速診斷試劑盒提供實驗依據(jù)。 方法:通過查閱文件并利用生物信息學軟件,篩選CPAF免疫優(yōu)勢區(qū)基因,以Cpn CWL029株基因組DNA為模板,高保真PCR擴增目的基因,構(gòu)建pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒;將重組目的基因轉(zhuǎn)化到E.coli BL21中,經(jīng)IPTG大劑量誘導表達蛋白,利用GST親和層析法純化重組蛋白,采用SDS-PAGE和Western-blot分析和鑒定產(chǎn)物;并在核酸蛋白分析儀中測定純化的蛋白濃度;用純化的CPAFm重組蛋白免疫6只BALB/c小鼠,用ELISA方法檢測小鼠血清中特異性抗體效價;取血清抗體效價高的小鼠的脾細胞,利用細胞融合技術,與骨髓瘤細胞SP2/0融合,制備雜交瘤細胞,利用間接ELISA法篩選分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株;采用有限稀釋法對陽性細胞株連續(xù)篩選3次,并進行單克隆擴大培養(yǎng);體內(nèi)誘生腹水法制備腹水型mAb,硫酸銨沉淀法純化,ELISA法和Western-blot法檢測mAb免疫反應性和效價,用mAb亞類測定試劑盒檢測mAb的類型;建立ELISA法檢測Cpn標準株和臨床呼吸道患者咽拭子中的Cpn抗原。 結(jié)果:pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒在E.coli BL21中經(jīng)IPTG誘導表達了相對分子量(Mr)約為51kDa的目的蛋白;目的蛋白以包涵體形式大量表達。復性后經(jīng)GST純化試劑盒純化,獲得純度在95%以上的目的蛋白。用純化后的目的蛋白免疫小鼠,間接ELISA法檢測血清中特異性抗體,其效價達到1:16000以上。取血清抗體效價高的小鼠脾細胞,采用細胞融合技術,與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合,制備出穩(wěn)定分泌mAb的4株雜交瘤細胞,分別命名為8E3、9G4、13D1和13D10。采用體內(nèi)誘生法大量制備腹水型mAb,并用飽和硫酸銨沉淀法純化,經(jīng)Western blot鑒定,腹水型mAb與CPAFm重組蛋白發(fā)生免疫反應,經(jīng)mAb亞類測定試劑盒測定,雜交瘤細胞株8E3和13D1分泌的mAb為IgG1,13D10和9G4分泌的mAb為IgG2b。用自制腹水型mAb采用ELISA法檢測550份臨床咽拭子標本,沒有檢測出陽性標本,而同時用PCR檢測出7例陽性標本。 結(jié)論: 1) 4株雜交瘤細胞株分泌的mAb均為IgG類抗體,能識別CPAFm重組蛋白和CPAF的天然抗原表位,具有良好的特異性; 2)自制腹水型mAb效價較低,可能是導致用此mAb建立的ELISA方法靈敏度低的原因之一 第二部分沙眼衣原體L2在不同細胞內(nèi)的生長情況 目的:研究沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)血清型L2在體外培養(yǎng)中的繁殖規(guī)律,探討L2在體外連續(xù)培養(yǎng)的方法,初步確定L2在體外培養(yǎng)的最佳生長發(fā)育條件,為臨床標本中L2的分離培養(yǎng)和進一步研究L2的相關實驗奠定基礎。 方法:用沙眼衣原體L2分別感染人喉癌細胞(Human Epidermoid Carcinoma-2, HEp-2)、人宮頸癌細胞(Henrietta Lacks strain of cancer cells,HeLa229)、人肝癌細胞株hepG-2(Human hepatoma cell line, HepG-2)、胃癌細胞(SGC-7901)和非洲綠猴腎異倍體細胞(Vero cells),熒光抗體染色,熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)不同時間后包涵體的形態(tài),比較其在不同細胞內(nèi)的生長情況,比較不同細胞對L2的敏感性。同時分別設DEAE葡聚糖處理組與非處理組,放線菌酮處理組與非處理組,通過比較培養(yǎng)12h、24h、36h和48h后包涵體形態(tài)及RT-PCR定量檢測的核酸量,判斷DEAE和放線菌酮對沙眼衣原體血清型L2生長的影響。 結(jié)果:在感染24h后,光學顯微鏡下觀察到HEp-2細胞、Vero細胞、HepG-2細胞、HeLa細胞和胃癌細胞中均不同程度腫脹,5種細胞內(nèi)均可見包涵體,大約40～48h后包涵體占據(jù)整個胞漿。熒光抗體染色法和RT-PCR結(jié)果顯示5種細胞中HeLa細胞感染率最高,HepG-2細胞感染率最低,L2在HeLa細胞中生長速度最快;熒光顯微鏡下進行包涵體計數(shù),發(fā)現(xiàn)DEAE葡聚糖預處理組和對照組中L2的感染率和生長發(fā)育沒有明顯區(qū)別。放線菌酮組中各細胞內(nèi)L2生長速度較對照組快,Real-Time PCR檢測結(jié)果顯示放線菌酮組各細胞內(nèi)L2核酸量較對照組高。 結(jié)論: 1)沙眼衣原體L2可感染HEp-2細胞、Vero細胞、HepG-2細胞、HeLa細胞和SGC-7901細胞,不同細胞對L2敏感性不一樣,并且在不同細胞內(nèi)生長情況也有明顯差異; 2)放線菌酮對L2包涵體的形態(tài)和密度有影響; 3) DEAE葡聚糖對L2的感染率沒有明顯影響。
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【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【參考文獻】

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