本文關(guān)鍵詞：高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的記憶效應(yīng)研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：[背景] 眾多的臨床試驗(yàn)均顯示高血糖介導(dǎo)的糖尿病相關(guān)并發(fā)癥在血糖控制正常后仍持續(xù)進(jìn)展,即所謂高血糖的“代謝記憶”�！按x記憶”的概念是在DCCT(糖尿病控制與并發(fā)癥試驗(yàn))研究后續(xù)的EDIC(糖尿病干預(yù)和并發(fā)癥的流行病學(xué)研究)研究結(jié)果公布后被提出的。在EDIC研究中,長(zhǎng)期隨訪結(jié)果表明：先前傳統(tǒng)治療組的視網(wǎng)膜病變、白蛋白尿、高血壓、神經(jīng)病變和心血管事件的發(fā)生率均高于強(qiáng)化治療組,而兩組的HbAlc水平并沒(méi)有明顯差異。隨著UKPDS研究10年隨訪結(jié)果的公布,血糖“的代謝記憶”在糖尿病患者中的存在得到了進(jìn)一步的證實(shí)。因此,糖尿病患者中存在著高糖的“代謝記憶”。 Kern實(shí)驗(yàn)室首次在糖尿病狗視網(wǎng)膜病變研究中報(bào)道了這種記憶效應(yīng)。結(jié)果顯示：高糖后2個(gè)月即獲嚴(yán)格控制的狗未出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變,而2.5年后開(kāi)始嚴(yán)格控制血糖的狗,其視網(wǎng)膜病變發(fā)生率則與整個(gè)5年中血糖控制不良的對(duì)照狗相似。Lorenzi實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn),鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在歷經(jīng)數(shù)周高血糖后,腎臟基底膜出現(xiàn)纖連蛋白mRNA的高表達(dá),而在糾正高糖后,其基底膜纖連蛋白mRNA仍持續(xù)高表達(dá)。隨后他們發(fā)現(xiàn),人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在經(jīng)歷數(shù)周高血糖后,也會(huì)出現(xiàn)類似的記憶效應(yīng),表現(xiàn)為糾正高糖后,粘連蛋白mRNA及Ⅳ型膠原mRNA的持續(xù)高表達(dá)。 2007年,Ihnat等在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞上進(jìn)行了有關(guān)記憶效應(yīng)及其機(jī)制的相關(guān)研究。研究采用高糖環(huán)境中培養(yǎng)14天后在正常葡萄糖水平下培養(yǎng)7天的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ?觀察了活性氧在內(nèi)的大量氧化應(yīng)激指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),接受高糖刺激14天的細(xì)胞,在糾正高糖后,其高糖造成的損傷仍持續(xù)存在,主要表現(xiàn)為活性氧、蛋白激酶-C、凋亡蛋白等損傷指標(biāo)的持續(xù)升高。課題組進(jìn)一步對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探索,首次發(fā)現(xiàn)使用抗氧化劑清除自由基可以清除其細(xì)胞產(chǎn)生的記憶效應(yīng),提示記憶效應(yīng)的產(chǎn)生與高糖刺激后產(chǎn)生的大量活性氧存在著密切的關(guān)系。在08年的The Journal of Experimental Medicine上有研究報(bào)道,牛及人的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在接受16h高血糖(30mmol/L)刺激后,可引起NF-KB亞基p65基因的表達(dá)增加,而在血糖恢復(fù)正常后,p65基因表達(dá)的升高至少還可持續(xù)6天。實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),抗氧化應(yīng)激干預(yù)可以糾正高糖后炎性因子的持續(xù)高表達(dá),提示氧化應(yīng)激在高糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的記憶效應(yīng)中可能起了重要的作用,這與Ihnat等的發(fā)現(xiàn)相符。由此可見(jiàn),記憶效應(yīng)在細(xì)胞中也是存在的,而氧化應(yīng)激可能是其產(chǎn)生的重要機(jī)制。 胰島p細(xì)胞凋亡與功能障礙是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié),加強(qiáng)對(duì)其相關(guān)機(jī)制的研究具有重要意義。既往研究提示,慢性高血糖可以造成胰島p細(xì)胞凋亡,而導(dǎo)致胰島功能的進(jìn)行性衰竭,即所謂的“葡萄糖毒性”。進(jìn)一步的研究提示,氧化應(yīng)激是造成胰島β細(xì)胞“葡萄糖毒性”的重要機(jī)制之一。氧化應(yīng)激是指由于活性氧簇(ROS)產(chǎn)生速率超過(guò)其被清除的速率,引起ROS的過(guò)度蓄積,最終造成細(xì)胞損傷和功能障礙的現(xiàn)象。體內(nèi)的各種組織細(xì)胞中,胰島β細(xì)胞內(nèi)超氧化物岐化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)等抗氧化酶含量較其他組織細(xì)胞低,且胰島p細(xì)胞DNA對(duì)于氧化損傷的修復(fù)能力差,故對(duì)氧化應(yīng)激極為敏感,易受到活性氧的損傷。 綜上所述,高糖刺激可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞炎性基因的持續(xù)表達(dá),凋亡蛋白的持續(xù)增高,線粒體DNA的持續(xù)損傷等多種記憶效應(yīng)的形成,此記憶效應(yīng)形成的關(guān)鍵可能是ROS的過(guò)度生成。胰島β細(xì)胞由于抗氧化酶的含量及活性均較低,故易受氧化應(yīng)激損傷。那么高糖誘導(dǎo)胰島細(xì)胞自身的氧化應(yīng)激損傷是否也會(huì)誘導(dǎo)胰島細(xì)胞產(chǎn)生記憶效應(yīng),造成胰島細(xì)胞持續(xù)的損傷呢?目前未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。胰島p細(xì)胞損傷是糖尿病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制,高糖誘導(dǎo)胰島細(xì)胞的凋亡是胰島細(xì)胞功能衰竭的重要原因,而細(xì)胞的凋亡又受到相關(guān)基因的調(diào)控。因此,本研究以INS-1細(xì)胞為研究對(duì)象,以bax,bcl-2,caspase-3這些調(diào)控凋亡的基因以及反映細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞活力來(lái)作為評(píng)估胰島細(xì)胞損傷的指標(biāo),觀察胰島細(xì)胞對(duì)高糖造成的損傷是否存在記憶效應(yīng),并初步探討其產(chǎn)生的可能機(jī)制。 研究分為以下兩個(gè)部分進(jìn)行： 第一章高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的記憶效應(yīng)的現(xiàn)象觀察 [目的] 觀察高糖刺激及糾正高糖后INS-1細(xì)胞是否存在持續(xù)性損傷。 [研究對(duì)象和方法] 1、以大鼠胰島p細(xì)胞瘤株INS-1細(xì)胞為研究對(duì)象,采用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。 2、實(shí)驗(yàn)分為4組： (1)對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為11.1mmol/LRPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天)。 (2)高糖組(細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為33.3mmol/LRPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天)； (3)3天記憶組(33.3mmol/L葡萄糖培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)為11.1mmol/L葡萄糖培養(yǎng)3天)； (4)5天記憶組(33.3mmol/L葡萄糖培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)為11.1mmol/L葡萄糖培養(yǎng)5天)。 3、四氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力：各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后,分別經(jīng)MTT、二甲亞砜處理后,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490nim處的光吸收值(OD值)。結(jié)果以正常對(duì)照組OD值標(biāo)化余各組OD值,即設(shè)定正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%,由此計(jì)算余各組細(xì)胞活力百分比。 4.RT-PCR檢測(cè)各組的細(xì)胞的mRNA水平：用Trizol試劑提取各組總RNA。提取的RNA測(cè)定其濃度與純度,經(jīng)測(cè)定樣本純度為符合條件2A260/2801.8后,采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。ABI-7500定量PCR儀利用染料法進(jìn)行PCR反應(yīng)后,分別觀察溶解曲線,擴(kuò)增曲線,并對(duì)不同組內(nèi)的目的基因產(chǎn)物和管家基因產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得出基因表達(dá)的相對(duì)定量(由RQ值表示),以此反映其mRNA水平的變化。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,若方差齊性,各組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),若方差不齊,采用Welch法近似方差分析；組內(nèi)多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法。P≤0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1、各組細(xì)胞OD值檢測(cè)：對(duì)照組、高糖組、3天記憶組、5天記憶組OD值分別是1.132±0.161,0.578±0.094,0.656±0.077,0.632±0.067。根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞活力后,對(duì)各組細(xì)胞活力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)照組、高糖組、3天記憶組、5天記憶組細(xì)胞活力分別是：1.000±0.000,0.520±0.122,0.583±0.048,0.597±0.075。與對(duì)照組比較,高糖組細(xì)胞活力顯著下降(P=0.016)。3天記憶組、5天記憶組細(xì)胞活力也較對(duì)照組顯著下降(P=0.002,P=0.006)。 2、各組mRNA表達(dá)水平比較：對(duì)照組、高糖組、3天記憶組、5天記憶組bax RQ值(基因表達(dá)的相對(duì)定量)分別是1.000±0.000,1.886±0.101,2.968±0.198,3.173±0.221;caspase-3的RQ值分別是1.000±0.000,1.692±0.212,2.468±0.499,2.253±0.563；bcl-2的RQ值分別是1.000±0.000,0.474±0.131,0.546±0.155,0.562±0.086。與對(duì)照組比較,高糖刺激INS-1細(xì)胞2天后,bax, caspase-3 mRNA水平顯著增加(P=0.002,P=0.002)。在糾正高糖后的第3天,第5天,bax mRNA水平較對(duì)照組仍顯著增高(P值均為0.001)。在糾正高糖后的第3天,第5天,caspase-3 mRNA水平較對(duì)照組也仍顯著增高(P=0.004,P=0.013)。高糖刺激INS-1細(xì)胞2天后,bcl-2 mRNA水平顯著降低(P=0.015),在糾正高糖后的第3天,第5天,bcl-2的mRNA水平較對(duì)照組仍顯著降低(P=0.036,P=0.008)。 [結(jié)論] 1、高糖可以通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因,誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致其細(xì)胞數(shù)量減少,功能受損。 2、INS-1細(xì)胞對(duì)高糖的損傷存在記憶效應(yīng),在糾正高糖后,其細(xì)胞仍持續(xù)損傷,主要表現(xiàn)為細(xì)胞活力的持續(xù)降低,促凋亡基因的持續(xù)高表達(dá),抑凋亡基因的持續(xù)低表達(dá)。 第二章高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的記憶效應(yīng)機(jī)制初探 [目的] 初步探討高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞產(chǎn)生記憶效應(yīng)的機(jī)制。 [研究對(duì)象和方法] 1.研究對(duì)象為大鼠胰島β細(xì)胞瘤株INS-1細(xì)胞。 2、實(shí)驗(yàn)分為4組： (1)對(duì)照組(細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為11.1mmol/LRPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天)； (2)高糖組(細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為33.3mmol/LRPMI1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天)； (3)記憶組(33.3mmol/L葡萄糖培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)為11.1mmol/L葡萄糖培養(yǎng)5天)； (4)干預(yù)組(33.3mmol/L葡萄糖培養(yǎng)2天后,轉(zhuǎn)為11.1mmol/L葡萄糖+終濃度為62.5umol/L的α-硫辛酸共同培養(yǎng)5天)。 3、抗氧化應(yīng)激干預(yù)：選用的抗氧化劑為L(zhǎng)ipoic acid(α-硫辛酸),為黃色粉末,分子量為206.33,根據(jù)分子量配制成終濃度大于62.5umol/L的母液,分裝后-20℃保存?zhèn)溆�。�?shí)驗(yàn)正式進(jìn)行時(shí),取母液配成終濃度為62.5umol/L的工作液,加入干預(yù)組培養(yǎng)基中。 4、細(xì)胞ROS產(chǎn)量的檢測(cè)：以DHE為熒光探針,在300nm激發(fā)波長(zhǎng),610nm發(fā)射波長(zhǎng)的設(shè)置下,酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞ROS平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立不添加探針的陰性對(duì)照組。 5、四氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力：各組細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后,分別經(jīng)MTT、二甲亞砜處理后,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490nm處的光吸收值(OD值)。結(jié)果以正常對(duì)照組OD值標(biāo)化余各組OD值,即設(shè)定正常對(duì)照組細(xì)胞活力為100%,由此計(jì)算余各組細(xì)胞活力百分比。 6、RT-PCR檢測(cè)各組的細(xì)胞的mRNA水平：用Trizol試劑提取各組總RNA。提取的RNA測(cè)定其濃度與純度,經(jīng)測(cè)定樣本純度為符合條件后,采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。ABI-7500定量PCR儀利用染料法進(jìn)行PCR反應(yīng)后,分別觀察溶解曲線,擴(kuò)增曲線,并對(duì)不同組內(nèi)的目的基因產(chǎn)物和管家基因產(chǎn)物進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,得出基因表達(dá)的相對(duì)定量(由RQ值表示),以此反映其mRNA水平的變化。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,若方差齊性,各組均數(shù)比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),若方差不齊,采用Welch法近似方差分析；組內(nèi)多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法。P≤0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 [結(jié)果] 1、各組mRNA表達(dá)水平比較： (1)對(duì)照組、高糖組、記憶組、干預(yù)組的bax RQ值分別是1.000±0.000,2.241±0.310,3.016±0.240,1.427±0.189。與對(duì)照組比較,高糖組及記憶組的bax mRNA表達(dá)水平顯著升高(P0.001)。與記憶組比較,干預(yù)組的bax mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.001)。 (2)對(duì)照組、高糖組、記憶組、干預(yù)組的caspase-3的RQ值分別是1.000±0.000,1.774±0.119,2.403±0.427,1.218±0.177。與對(duì)照組比較,高糖組及記憶組的caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004,P=0.027)。與記憶組比較,干預(yù)組的caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P=0.029)。 (3)對(duì)照組、高糖組、記憶組、干預(yù)組的bcl-2的RQ值分別是1.000±0.000,0.496±0.094,0.559±0.130,0.903±0.093。與對(duì)照組相比,高糖組,記憶組bcl-2mRNA水平顯著降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,P=0.002),干預(yù)組bcl-2 mRNA水平較記憶組顯著上升(P=0.003)。 2、各組細(xì)胞ROS產(chǎn)量：對(duì)照組、高糖組、記憶組、干預(yù)組ROS產(chǎn)量分別是0.549±0.170、1.086±0.120、0.992±0.113、0.699±0.114。與對(duì)照組相比,高糖組,記憶組ROS水平顯著升高(P0.001)。干預(yù)組的ROS水平較記憶組顯著下降(P=0.001)。 3、各組細(xì)胞活力檢測(cè)：對(duì)照組、高糖組、記憶組、干預(yù)組OD值分別是1.126±0.166、0.554±0.088、0.592±0.084、1.083±0.181。根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞活力后,對(duì)各組細(xì)胞活力進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,對(duì)照組、高糖組、記憶組、干預(yù)組細(xì)胞活力分別是：1.000±0.000、0.500±0.101、0.553±0.093、0.977±0.210。與對(duì)照組相比,高糖組、記憶組細(xì)胞活力均顯著下降(P0.001)。干預(yù)組與記憶組比較,細(xì)胞活力顯著升高(P=0.014)。 [結(jié)論] 1、ROS水平的持續(xù)升高與高糖誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞損傷的記憶效應(yīng)產(chǎn)生有密切關(guān)系,氧化應(yīng)激可能是高糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷的記憶效應(yīng)的重要機(jī)制。 2、抗氧化干預(yù)可以在一定程度上減少高糖誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞的持續(xù)性損傷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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2 翁帆;曾遠(yuǎn)偉;龔誠(chéng)華;戴麗萍;周煥寧;蔡梅英;曾立志;;廣州市越秀區(qū)2004—2010年居民意外傷害死亡病例分析[J];華南預(yù)防醫(yī)學(xué);2011年06期

3 顧麗萍;吳藝捷;;Caspase與胰島β細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).內(nèi)分泌學(xué)分冊(cè);2005年06期

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本文編號(hào)：1362167